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and DXS8050 on Xq25.This result will be helpful for the indentification of disease gene.
【Key words】 Smith-Fineman-Myers syndrome Gene mapping Short tandem repeat markers
Linkage analysis
Smith-Fineman-Myers综合征(Smith-Fineman-Myers syndrome,SFMS)是一种X连锁智能低下综合征，其主要临床表现为智能低下、异常面容、小下颌、小头、侏儒、癫痫和肌张力低下。SFMS的病因目前尚不清楚，克隆SFMS基因将有助于阐明其病因和发病机理。作为基因克隆的第一步，首先需要对SFMS基因进行定位。为此，我们应用覆盖X染色体全长的25个多态的短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点对一个SFMS家系进行了连锁分析，发现位于X染色体Xq25上的DXS1001与致病基因连锁，两点连锁lod得分为3.01(θ＝0)。对位于DXS1001两侧的STR多态位点分析发现，SFMS也与DXS1001近侧(着丝粒侧)的DXS8067和DXS1001远侧(端粒侧)的DXS8059、DXS1212、DXS8098、DXS1206和DXS8009紧密连锁，通过单体型分析，将SFMS基因定位于DXS8064和DXS8050之间，该区域为14.6cM。
1 对象与方法
1.1 对象 所分析的家系是我室在山东省遗传病调查中发现的，对家系中患者的临床特征及疾病传递方式已有报道［1］，家系中共有5名男性患者和24名相关成员，疾病呈X连锁隐性遗传。我们对13名能明确提供连锁分析信息的家庭成员的DNA进行了分析(图1)。
图1 Smith-Fineman-Myers syndrome家系中各成员的单体型及其在家系中的分离情况
Fig 1 Haplotypes and their segregation in a Smith-Fineman-Myers Syndrome family
1.2 方法
1.2.1 外周血细胞DNA提取 按常规DNA提取方法从患者及其家庭成员外周血细胞中提取DNA，经紫外分光光度法进行定量，然后稀释到20ng/μl的浓度备用。
1.2.2 STR标记位点 由于缺乏SFMS候选基因，我们对整个X染色体进行了扫查。STR标记位点的选择取决于它们在X染色体上的位置及其杂合子频率。在初筛时，我们以8～10cM的间距选择STR，一旦提示连锁，则对连锁的STR两侧的其它STR进行分析。用来扩增STR多态位点的所有引物均购自美国Research Genetics公司。
1.2.3 引物标记及PCR扩增 在T4多核苷酸激酶(New England Biolab)的作用下，用32P-ATP (ICN)末端标记引物对中的一个引物，然后进行PCR扩增。扩增体系为10 μl，内含基因组DNA 40ng，1×PCR缓冲液，0.2μmol/L的每种引物，200μmol/L的各种dNTP和0.5U Taq DNA聚合酶。扩增条件为：94℃预变性4分钟，然后进行35个循环(94℃ 40秒，55～60℃ 40秒，72℃ 50秒)，最后一次循环在72℃延伸7分钟。
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 扩增反应完成后，加入等体积的变性缓冲液(95%甲酰胺，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，10mmol/L EDTA)混匀，95℃变性5分钟后迅速置冰浴上。每份样本取4μl上样于6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上，恒功率60W电泳2.5～3小时，凝胶经干燥后放射自显影12～24小时。
1.2.5 基因型分析 将样本中各位点等位基因片段按大小依次编号为1、2、3等，记录各成员的基因型。
1.2.6 连锁分析 用LINKAGE软件包中的MLINK计算致病基因与各多态位点之间的两点连锁lod得分［2］，SFMS的遗传方式设为X连锁隐性遗传完全外显，致病基因频率设为10-5，多态位点的各等位基因频率设为1/N，其中N为在该位点上观察到的等位基因数。
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