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非小细胞肺癌中p16基因的突变研究 |
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;。应用美国PE公司DNA Thermal Cycler进行PCR扩增。95℃变性5分钟；95℃ 10秒，68℃ 10秒，72℃ 30秒，4个循环；95℃ 10秒，66℃ 10秒，72℃ 30秒，4个循环；95℃ 10秒，64℃ 10秒，72℃ 30秒，4个循环；95℃ 10秒，62℃ 10秒，72℃ 30秒，4个循环；95℃ 10秒，60℃ 10秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃ 7分钟后结束反应。采用低熔点琼脂糖(BRL)回收目标区带并置入1.5ml Eppendorf管中。应用Promega公司Wizard PCR Preps试剂盒纯化p16基因PCR产物。在进行p16基因纯合缺失分析的PCR扩增反应中，我们使用了一对α1-AT基因的引物作为内对照。
1.3 肺癌p16基因序列分析
1.3.1 引物末端标记 取引物(外显子2)1pmol，5×激酶缓冲液1μl，γ-32P-ATP〔＞185TBq/mmol，(5000Ci/mmol)〕1μl，T4激酶1U，37℃反应30分钟；再置55℃，5分钟终止反应，置冰浴中备用。
1.3.2 测序反应 取模板DNA 50 fmol，标记引物1pmol，10×Taq测序缓冲液4.5μl，Taq DNA聚合酶2.5U，制备成预反应液，混匀，离心后将预反应液分别取8μl，加入到含有4种dNTP和1种ddNTP的标记为G、A、T、C的4个反应管中，加入10μl矿物油复盖其上，用PE公司DNA Thermal Cycler仪完成PCR反应，95℃变性30秒，62℃退火30秒，70℃延伸60秒，共30个循环。
1.3.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 G、A、T、C 4管反应中每管加入终止反应液3μl，置95℃变性7分钟后，立即加入6%变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度＝19∶1，7mol/L尿素，离子强度为1×TBE)电泳孔中，在DNA测序装置(Bio-Rad公司)中40W恒功率电泳2～3小时。电泳完毕后，-70℃放射自显影18～24小时。
2 结果
2.1 肺癌p16基因PCR扩增与纯化结果 应用上述PCR反应条件以40例肺癌及相应正常组织基因组DNA为模板扩增p16基因外显子2，有两例样品(T2和T9)未扩增出p16基因。
2.2 肺癌p16基因外显子2序列分析结果 应用PCR双链DNA直接测序法分析了38例肺癌DNA样品中p16基因外显子2的序列，所获结果见表1，图1，2。
表1 非小细胞肺癌中p16基因外显子2的序列分析结果
Tab 1 p16 mutations in 38 non-small cell lung carcinomas
Case
(病例) Mutation
(突变) Coding change
(密码子改变) Location(bp/codon)
(突变位置)
4 A→T Tyr→Phe 380/121
T→A Leu→Gln 185/56
5 T→A Samesense 225/69
C→A Leu→ILe 226/70
10 T→A Samesense 225/69
C→A Leu→ILe 226/70
12 A→G Tyr→Cys 380/121
13 A→C Tyr→Ser 380/121
15 A→T Tyr→Phe 380/121
17 A→C Tyr→Ser 380/121
19 T→A Samesense 225/69
C→A Leu→ILe 226/70
21 1 base deletion Frameshift 307/97
23 C→A Samesense 261/81
C→A Samesense 253/79
34 A→C Tyr→Ser 380/121
35 A→C Tyr→Ser 380/121
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