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食管癌及癌旁组织中基因表达的初步研究 |
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n lead to the identification of EC-specific genes which may be helpful for the development of diagnostic and prognostic biomarkers or therapeutic targets. The differential hybridization technique of AtlasTMHuman cDNA expression array can be a useful method for describing the expression profiles of a tissue of cell interested.
【Key words】 Esophageal cancer Gene expression profile Differential hybridization Atlas cDNA expression array
食管癌是我国高发恶性肿瘤之一，其中鳞癌占大部分，在对其发病机理的研究中，发现涉及多条染色体和多个基因的改变［1］。由于人类基因组计划(human genome project,HGP)的快速进展，大量的新基因被发现，Atlas微点阵表达分析膜的差异杂交可快速地对许多基因的表达状况进行了解，Sehgal等［2］已采用该方法成功地分析了恶性胶质瘤的基因表达概况，并找到了一个恶性胶质瘤细胞增殖所必需的基因。为了解食管癌特异的基因表达谱，寻找在食管癌及癌旁组织中的差异表达基因，我们采用该技术分析了588种已知基因在食管癌中的表达概况，为全面了解食管癌的基因表达谱及最终揭示其发病机理前进了一步。
1 材料与方法
1.1 材料 6对食管癌及相应癌旁组织取自中国医学科学院肿瘤医院胸外科，术前患者均未接受过放疗或化疗，病理诊断癌组织为中到高分化鳞癌，癌旁组织为正常或单纯性增生鳞状上皮，并除外癌细胞浸润。Atlas cDNA expression arrays购自CLONTECH公司，放射性同位素α-32PdATP购自Du-Pont公司。
1.2 方法
1.2.1 取材及组织处理 食管癌切除手术中，组织离体后立即在癌灶生长旺盛处取癌组织，在手术切端取癌旁组织，置于含20%小牛血清、100 U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的199培养液中，于离体1小时内在上述培养液中行显微剥离，去除血管、结缔组织，并纵切取一小部分用于病理鉴定，余置于液氮中保存。
1.2.2 polyA+RNA提取及差异杂交 以Trizol试剂(GIBCO公司)提取癌及癌旁组织总RNA，分别从各个癌或癌旁组织总RNA取等量样本合并作为癌或癌旁总RNA，以Oligotex试剂盒(QIAGEN公司)分离纯化polyA+RNA，按Clontech公司操作手册，分别反转录合成cDNA第1链，并掺入放射性同位素作探针，与两张相同的Atlas滤膜于68℃杂交16小时，洗膜条件为2×SSC、1%SDS 68℃ 15分两次，0.2×SSC、0.5% SDS 68℃ 20分钟两次，于-70℃放射自显影。结果分析采用Bio-Rad公司Fluor-STM Multi Imager成像仪及Image Analysis Systems软件。
2 结果
6对癌及癌旁组织经显微剥离后癌细胞或粘膜上皮细胞纯度大于85%。各个癌组织及各个癌旁组织RNA分别等量合并后反转录为cDNA作为探针与Atlas滤膜差异杂交，结果见图1。该X光片经Fluor-STM Multi Imager成像仪扫描及Image Analysis Systems软件进行光密度分析后得出表达发生改变的基因。所分析的588个基因中表达差异大于30%的有83个，其中在癌组织中表达上调的有61个，表达下调的22个(部分表达发生改变的基因见表1，正数表示上调，负数表示下调)，与细胞增殖、凋亡、细胞信号传导、DNA损伤修复、细胞分化和肿瘤转移有关的基因的表达水平在癌组织中呈明显改变。
3 讨论
由于遗传背景和环境因素的差别，患同一种肿瘤的不同患者的癌细胞基因表达模式可能不尽相同。为寻找食管癌患者基因表达的共同规律，我们将6个患者组织的RNA等量合并，使每例样品对基因表达改变的贡献相同，使在多数样品中呈上/下调的基因在结果中显示明显的上/下调，结果反映了多数患者的共同趋势。上述结果表明，在食管癌组织中，对细胞增殖起促进作用的基因表达上调，起抑制作用的基因表达上一页 [1] [2] [3] 下一页
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