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先天性尿道下裂与SRD5A2及SRY基因突变关系研究 |
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of SRY gene was found, this study might suggest that the mutation of SRY gene is not an important event in hypospadias. Condon 227 is a hotspot site of mutation within the gene. The mutation of codon 186(Phe 186Leu) represents a new form of SRD5A2 mutation.
【Key words】 Hypospadias SRD5A2 gene SRY gene Male pseudohermaphroditism
有关先天性尿道下裂的病因目前仍未完全明了。雄激素分为睾酮(T)和双氢睾酮(DHT)。DHT是由胎儿睾丸分泌的睾酮在靶细胞的5α-还原酶的催化作用下转化而来。T主要诱导中肾管(Wolffian ducts)的男性化，形成精囊、输精管和附睾。而DHT则依次诱导外生殖器、尿道和前列腺的形成。故阴茎的发育主要是DHT的作用。5α-还原酶的作用下降将影响DHT的合成，从而影响尿道和外生殖器的形成［1-3］。因此，近年来5α还原酶基因突变与先天性尿道下裂关系的研究成为一个新的热点［4-7］。SRY基因是与性别分化相关的基因。亦有报道认为SRY基因的突变可能与尿道下裂发生有关［8］。
1 材料与方法
1.1 研究对象 随机收集1996年8月至1998年1月间在我校第一附属医院小儿外科住院的尿道下裂患者23例。
1.2 寡核苷酸引物序列 按文献［9，14］合成SRD5A2基因寡核苷酸引物和SRY基因寡核苷酸引物。SRD5A2基因引物在加拿大合成，SRY基因引物由中国科学院上海细胞所肿瘤研究所合成。
1.3 实验方法［9］
1.3.1 DNA提取 按常规方法提取患者外周血白细胞基因组DNA(酚提法)。
1.3.2 PCR 30μl PCR反应体系中，含DNA样品0.2～0.5μg，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，0.1% Triton-X 100和0.2mmol/L dNTP，上下游引物各20 pmol。反应在PE公司产热循环仪上进行。97℃ 7分钟变性后，热启动加1.5U Taq DNA聚合酶，反应条件：94℃变性45秒，复性温度60℃，40秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。取5μl反应物用1%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。
1.3.3 酶切 为增强SSCP分析的准确性及敏感性，我们又将扩增的SRD5A2基因第1外显子DNA片段用BamHI酶切为两个较小片段。
1.3.4 SSCP和银染 取10μl PCR产物与10μl变性剂混合，沸水浴5分钟后立即置于冰水浴中5分钟后上样。经6%～8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，0.5×TBE缓冲液，电压80～140V，室温电泳12～16小时。取胶，用0.2%的硝酸银染色。
1.3.5 DNA测序 将有电泳异常的标本再次扩增后，PCR产物用DNA纯化试剂盒按说明书进行纯化回收，采用相同引物作为测序引物，α-32P ATP标记引物，用测序试剂盒按说明书进行测序反应，经含7 mol/L尿素8%测序胶，1×TBE，50℃，1200V电泳至溴酚蓝接近胶下缘。取胶，放射自显影，读序。全部测序标本经正义链和反义链双向测序分析。
2 结果
2.1 全部标本均成功地扩增出SRD5A2基因的第1至第5外显子DNA片段和SRY基因的DNA片段。其中SRD5A2基因扩增产物片段长度分别为311bp、244bp、214bp、241bp和169bp。SRY基因扩增产物为254bp。扩增的SRD5A2基因第1外显子DNA片段均经BamHI酶切为86bp和225bp的两个片段。扩增DNA片段均与预测DNA片段大小相符。
2.2 尿道下裂样本SRD5A2基因组DNA的SSCP/银染结果 23例患者中经PCR-SSCP发现3例5α还原酶2基因的第4外显子DNA扩增片段出现电泳带位置异常。
2.3 尿道下裂样本SRY基因组DNA的SSCP/银染结果 本组患者经PCR-SSCP分析SRY基因的DNA扩增片段未发现异常(图1)。
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