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一个中国人群哮喘与5号染色体的连锁分析 |
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后4个均匀地分布在5q31-5q33区域，间距平均约10cM，而D5S418与D5S428分别远离D5S471 72.5cM和37.2cM。(2)PCR反应［10］：6对微卫星引物在5μl的总反应体系中共同扩增，10×PCR buffer 0.5μl，50mmol/L MgCl20.3μl，1.25mmol/L dNTPs 0.8μl，5U/μl Taq Polymerase 0.05μl，Taq StartTM antibody0.05μl，10μmol/L primer 0.025μl，50ng/μl Genomic DNA1.0μl。其中Taq StartTM抗体必须先与抗体缓冲液及Taq酶在室温下孵育5分钟，每个反应加4μl PCR混合物和1μl基因组DNA，在Perkin Elmer 9600热循环仪上进行PCR。反应条件为94℃变性20秒，72℃延伸60秒，在起始的14个循环中退火温度为63～56.5℃，每次递减0.5℃，持续时间为60秒，在后20个循环中，退火温度固定为56℃，60秒。(3)PCR产物稀释及ABI 373A测序仪凝胶电泳、基因分型：取0.5μl PCR反应产物与0.2μl ABI GS-350 TAMRA分子量标准和1.8μl甲酰胺上样液混合，95℃变性2分钟，冰浴迅速致冷，在ABI 373A测序仪上，6%聚丙烯酰胺和7mol/L尿素中电泳7小时，用GENESCANTM672软件进行数据收集、泳道线校正、内在分子量标准校正和迁移片段大小测量，应用GenotypeTM软件进行基因分型。
1.2.3 统计学方法 哮喘患者与正常人两组的特应症发生率的比较采用Fisher直接机率法。
1.2.4 连锁分析 应用FASTLINK软件包(2.3版)中的MLINK连锁分析软件［11］，在隐性遗传的完全外显模式下，分别在设定重组率为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4时计算Lod值。疾病基因的频率设定为0.05。表型分别是支气管哮喘和特应症。
2 结果
2.1 临床资料 研究对象一般情况见表1。
表1 大别山哮喘核心家系一般情况
Tab 1 General characteristics of the nuclear families from Dabie Mountain(%)
Asthma
(哮喘患者) Normal
(正常人) Total
(合计)
Number
(例数) 34 14 48
Atopy
(特应征) 24/34(0.71)* 2/14(0.14) 26/48(0.54)
* P＜0.01，compared with normal control(与正常对照比较，有统计学意义)
皮肤挑刺试验阳性者认为有特应征(Atopy)，哮喘患者中大部分为过敏性哮喘，占71%，与正常组相比有统计学意义(P＜0.01)。过敏原包括：蟑螂(76.9%)、屋尘(73.1%)、尘螨(46.2%)、花粉(34.6%)、豚草(30.8%)、兽毛(26.9%)、花生(11.5%)、真菌(7.7%)、羽毛(3.8%)等。
2.2 连锁分析
2.2.1 支气管哮喘与5号染色体几个微卫星标记不存在连锁关系，结果见表2。
2.2.2 特应症与5号染色体几个微卫星标记不存在连锁关系，结果见表3。
表2、3说明：取不同的重组率θ，得到一系列Lod值，对应最大Lod值的θ值，即为该座位的最大似然估计值。当Lod值＞1时，有可能存在连锁；若Lod值＞3时，则肯定连锁；Lod值＜-2则否定连锁。
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