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食管癌低表达cDNA片段C6 |
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expressed in fetal esophageal mucosa, skin, cerebrum,placenta;moderately expressed in fetal stomach and liver, but not detected in fetal heart, small intestine and kidney. Conclusion The high frequency of deletion of decreased expression of C6-2A in esophageal cell lines and human esophageal cancer tissues suggested that C6-2A might be involved in the carcinogenesis of esophagus.
【Key words】 Esophageal cancer mRNA differential display Gene expression cDNA
癌变过程中伴随着多种癌基因的扩增、过度表达及抑癌基因的缺失、突变或低表达。基因的选择性表达决定细胞的生长、发育、分化，与肿瘤增殖、侵袭、转移等生物学行为相关［1］。分离、克隆食管癌发生、发展过程中关键的差异表达基因，可从分子水平为疾病的早期诊断和基因治疗提供较特异的靶点。我们应用mRNA差异显示技术，分离、克隆了3个cDNA片段。其中，C6-2A经RT-PCR、Northern blot及dot blot证实，在正常食管上皮和食管癌组织之间有显著的表达差异。
1 材料和方法
1.1 临床资料 配对的手术切除的食管癌组织及切端正常粘膜上皮，取自河南安阳肿瘤医院和中国医学科院肿瘤医院，用于mRNA差异显示的3例配对组织均为男性，年龄64～70岁，无家族史。临床病理为鳞癌2例，分别为T2N0M0和T3N1M0，腺癌1例，T3N1M0。胎儿组织取自水囊引产的5个月女性胎儿。液氮保存备用。食管癌细胞系EC109、EC8712和EC9706由本室建立。
1.2 总RNA提取、逆转录及差异显示PCR扩增按文献［2］报道的方法进行。
1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 按文献［3］报道的方法进行银染。
1.4 差异条带的回收及PCR再扩增 按文献［2］的方法进行。
1.5 cDNA连接、转化及测序 克隆到pGEM-T Easy载体，阳性质粒DNA送大连宝生物公司测序。
1.6 Northern blot及dot blot分析 总RNA 20μg用含2.2mol/L甲醛的1.2%变性琼脂糖凝胶电泳分离后，毛细管法转至Zeta-Probe Blotting膜。点杂交时每孔总RNA上样10μg。取质粒DNA酶切回收片段25ng，以Prime-a-Gene系统标记放射性探针，按常规进行预杂交、杂交、洗膜及放射自显影。
1.7 RT-PCR检测 按测序结果设计C6-2A的特异引物，扩增产物141bp；以α-Tubulin引物作为内对照，扩增产物410bp。PCR循环：94℃预变性5分钟，94℃30秒、60℃30秒、72℃40秒，25～30次循环。72℃延伸5分钟。引物序列为：上游：2A GGAGTCCTCAGAC-TCTCCCC α-Tubulin CAGCCAGTCCAGATCCT-CTC；下游：2A CTCATCACAGGCAAGGAAGGAT α-Tubulin TTAAGGTTAGTGTAGGTTGGGC。
2 结果
2.1 cDNA扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳图 用OPC6随机引物PCR扩增3例配对的癌及手术切端正常粘膜上皮cDNA，3对病例均有差异的条带3处，但只有280bp处的差异带丰度较高，为便于克隆片段被Northern blot所验证，我们只回收此处(图1)。
2.2 测序结果及同源分析 差异条带回收、克隆、测序后，获得280bp、279bp、270bp 3个cDNA片段，分别命名为C6-2A、C6-3和C6-4。与GenBank基因数据库同源比较，C6-3与人线粒体基因99%同源，C6-4与人Lysyl tRNA合成酶的RNA100%同源，C6-2A未见与任何已知基因同源。但是，经查询EST数据库，发现C6-2A与ne27b03.s1 NCI-CGAP-C03人cDNA克隆IMAGE：898541序列99%(288/289)同源；与人卵巢肿瘤构建的cDNA克隆755196和740368均上一页 [1] [2] [3] 下一页
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