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萌发中花生胚轴的耐干性与热稳定蛋白 |
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1.1 植物材料 花生（Arachis hypogaea L.)品种粤油256种子由广东省农科院作物所提供。
1.2 花生种子的萌发率和耐干性测定 取50个种子放在垫有2层滤纸的直径为12cm的培养皿内，加10ml蒸馏水，在26℃恒温培养箱中萌发，吸胀后统计发芽率（胚根突破种皮3mm）并取出种子，剥取胚轴，弃去子叶。胚轴在25℃风扇下吹干12h后在装有硅胶的干燥器内继续干燥至含水量5%～6%。为检测吸胀后胚轴的耐干性，将胚轴接种于MS培养基上(无菌操作)，耐干性以胚轴在培养基上的生长百分率表示，4次重复。
1.3 可溶性蛋白和热稳定蛋白的提取 花生胚轴在液氮中研磨成粉，按1∶10 (W/V）的比例加入正己烷，在－20℃下过夜脱脂，1000 ×g离心后倾去正己烷，所得脱脂粉风干后备用。参照Blackman等(1991)和Yang等(1998) 方法，取30～40mg 脱脂粉，加入400μl预冷的提取缓冲液(mmol/L)：Tris-HCl 50 (pH 8.0)、 NaCl 500、2-ME 10、PMSF 1, 4℃冰浴研磨，10000×g离心20min (4℃)，吸取上清液。残渣加入400μl提取缓冲液再提取一次，合并上清液(可溶性蛋白提取液)。取上述蛋白提取液，100℃水浴中煮10min，冰浴中冷却15min，于10000×g离心10min，上清即为热稳定蛋白。上清液加入4倍体积的冷丙酮（-20℃),于-20℃过夜沉淀蛋白。10000×g离心10min收集沉淀，贮于-20℃，用于电泳分析。
1.4 蛋白质含量测定 按Bradford (1976) 的方法，用牛血清蛋白（上海东风生化试剂厂）作标准曲线。
1.5 电泳分析 SDS-PAGE依Laemmli (1970) 的方法改进。取蛋白质沉淀按10μg/μl 加入样品缓冲液： Tris-HCl 50mmol/L (pH 6.8)、2.3%SDS、10%甘油，5% 2-ME，0.1%溴酚蓝，100℃水浴3min，每泳道上样蛋白量80μg，标准蛋白质（上海东风生化试剂厂）分子量范围为14.4～97.4kD。双向电泳按Damerval 等(1986) 的方法改进。蛋白质沉淀按20μg/μl的比例加入样品溶解液：尿素9mol/L（超纯，Serva）、2%NP-40(Serva)、2%DDT(Serva)、1.6%的pH 8与0.4%的pH 3.5～10的Ampholine (上海东风生化试剂厂)，于37℃温育10min溶解样品。第一向每管上样蛋白量600～800μg，第二向采用垂直板电泳。
2 结 果
2.1 花生种子萌发过程中胚轴耐干性的变化
花生种子吸胀12h后，胚根开始伸长；至吸胀18h，种子100%萌发。种子萌发过程中的吸水变化呈现3个变化时期(图1)。萌发生长试验表明，吸胀18h内的胚轴经干燥后全部能忍受再脱水并能生长;但吸胀24h或超过24h的胚轴经脱水干燥后，则丧失萌发生长能力（图2）。由此可见，花生种子完成萌发时（吸胀后18h），胚轴仍然具有耐干能力，当胚根突破种皮后，则干燥造成致死伤害。
图 1 花生种子吸胀后鲜重及发芽率变化
Fig.1 Changes in fresh weight and germination percentage of peanut seeds after imbibition
图 2 花生种子吸胀后胚轴耐干性的变化
Fig.2 Changes in desiccation tolerance of peanut axes after imbibition
2.2 花生种子萌发过程中胚轴可溶性蛋白和热稳定蛋白含量的变化
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