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白芷细胞外21kD钙调素结合蛋白的生理功能初探 |
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发及花粉管伸长（Ma和Sun 1997）等功能。在细胞内，活化CaM（Ca2+.CaM）一般是通过钙调素结合蛋白（CaMBP）或依赖CaM的蛋白质磷酸化作用调节细胞的生理功能，那么细胞外Ca2+.CaM是否也通过与胞外存在的CaMBPs结合后而直接发挥作用呢？Tang等（1996）首次在白芷悬浮培养细胞外检测到CaMBP的存在，并初步微量纯化了一种主要存在于细胞壁上、依赖于Ca2+的分子量为21kD的CaMBP。宋春风等(1997)则用电镜方法证实了白芷细胞壁上确实存在CaMBPs。那么，胞壁存在的CaMBPs，尤其是21kD CaMBP，在胞外CaM发挥生物学功能时起何种作用呢？本文制备了纯化的21kD CaMBP及其特异性抗体，研究了21kD CaMBP对白芷悬浮培养细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 白芷悬浮培养系的建立 取生长旺盛的白芷(Angelica dahurica)愈伤组织1g,放入盛有200ml MS液体培养基的三角瓶中,MS培养基中含蔗糖30g/L、2,4-D 1mg/L、6-BA 0.5mg/L。在(26±1)℃条件下,100r/min振摇培养15～20d,即进入对数生长期。悬浮系每隔15d转换一次。取培养至第10～13天的白芷悬浮细胞液,依次分别通过30、60和100目的无菌尼龙筛网,即得单细胞悬浮系，可将细胞稀释到合适的密度备用。
1.2 胞外21kD CaMBP分离纯化 按Tang等(1996)方法,先制备白芷悬浮培养细胞CaCl2(0.1mol/L) 盐提溶液及其70%乙醇沉淀蛋白样品，然后用Sephadex G-100凝胶过滤柱及CM-Sepharose阳离子交换柱纯化制备21kD CaMBP。
1.3 21kD CaMBP纯度鉴定 提纯的21kD CaMBP经SDS-PAGE及IEF分离后以考马斯亮蓝染色,并用紫外薄层扫描鉴定其纯度。
1.4 纯化21kD CaMBP与CaM的结合特性 按Tang等（1996）方法，用生物素-CaM凝胶覆盖（gel overlay）技术检测。
1.5 蛋白含量测定 按Bradford(1976)法,用BSA作标准蛋白。
1.6 21kD CaMBP抗体制备 参考魏群等(1991)免疫小鼠腹水法，每只小鼠每次免疫量为100μg 21kD CaMBP，共免疫3次，每次间隔2周，第3次免疫后的隔天腹腔注射骨髓瘤细胞SP2/0（6.5×106个/只），7～10d后引流腹水，测效价即得免疫腹水；同批小鼠中取3只，每只注射0.5ml液体石蜡，2周后腹腔注射同样量的SP2/0细胞，7～10d后引流腹水，即得未免疫腹水。所得腹水经50%饱和硫酸氨沉淀部分纯化后，分装，于－70℃保存。
1.7 21 kD CaMBP抗体特异性的检测 用免疫印迹法，参照Hames（1990）。
1.8 白芷悬浮培养细胞增殖试验 取适当密度的细胞悬浮液4ml,加入到25ml三角瓶中,然后加入过滤除菌的21kD CaMBP或其抗体（部分纯化免疫腹水），终浓度为0.21、0.84、4.9、8.4μg/ml或12.5、25、50和100μg/ml,在(26±1)℃下,振荡培养7d,取出计数。同时,以相同浓度的BSA代替21kD CaMBP,以部分纯化的未免疫腹水代替免疫腹水做阴性对照。
2 结 果
2.1 纯化的白芷悬浮培养细胞外21 kD CaMBP
按Tang等（1996）方法，从白芷悬浮培养细胞 CaCl2(0.1mol/L)盐提溶液中制备纯化了一个分子量21kD的蛋白（图1-3、4）。由于制备的盐提溶液中未检测到6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性，排除了细胞内蛋白污染的可能性，并且此纯化蛋白经生物素-CaM凝胶覆盖检测表明是一种依赖Ca2+的CaMBP（图2-2），因此，上述纯化的蛋白即为胞外21kD CaMBP。纯化的21kD CaMBP经SDS-PAGE及IEF分离都表现为一条带，且测得其等电点的pH为8.9 (图3)。另外，经紫外薄层扫描显示其纯度达94.1%，可以用作抗原制备抗体。
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