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人脑肿瘤猴病毒40的感染状况及来源研究 |
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猴病毒40(simian virus 40,SV40)是乳多空病毒科多瘤病毒属双链DNA肿瘤病毒，可诱发多种动物多个部位或器官产生肿瘤，体外可使动物和人正常细胞发生恶性转化，对脑组织有嗜性，并在人脑的多种肿瘤组织检测到其相关核苷酸序列［1，2］。我们采用聚合酶链反应(PCR)和斑点杂交(dot blot)技术，检测了516份人脑肿瘤组织，健康人外周血80 份，精液50份，人胚胎组织100份及30份正常人脑组织中的SV40 DNA序列，旨在探讨SV40的感染状况及来源，并进一步揭示SV40感染与脑肿瘤的关系。
材料与方法
一、组织标本
选取经病理组织学检查确诊的516份脑肿瘤标本(347份为石蜡包埋组织，169份为手术切除的新鲜组织，取材后立即置－70℃保存)。其中胶质瘤256份，脑膜瘤103份，脑垂体腺瘤83份，颅内神经鞘瘤42份，先天性肿瘤32份。另取健康献血员外周血80份，健康人精液50份，人工流产胚胎组织100份以及无神经系统肿瘤的正常脑组织标本30份作为对照。SHG44和BT325 细胞株分别由苏州医学院和北京神经外科研究所提供。
二、组织DNA制备
石蜡组织分块取5～10 μm厚薄片5片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，10%SDS及蛋白酶K消化，煮沸10 min后，取上清液用于PCR。新鲜组织置于玻璃匀浆器中研碎，SDS、蛋白酶K及1%NP4 0裂解，饱和酚、氯仿提抽，无水乙醇沉淀，三蒸水溶解备用。细胞及外周血DNA的提取按经典分子生物学方法提取。
三、PCR扩增SV40早期区域基因序列
引物参照Bergsagel等［3］文献报道设计，由Giblco公司合成，核苷酸序列为：5′- CTTTGGAGGCTTCTGGGATGCAACT-3′；5′-GCATGACTAAAAAACTTAGCAATTCTG-3′。在总体积50 μl的反应体系中，含样品液10 μl，dNTP各0.2 mmol/L，一对引物各50 pmol/L，Taq DNA聚合酶3 U。PCR扩增60次，94℃ 1 min，56℃ 30 s，72℃ 30 s。循环结束后，置72℃ 5 min。另以SV40 DNA克隆片段为阳性对照，阴性对照以灭菌三蒸水代替DNA，同时进行扩增。取10 μl扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳(图1)。
M：PCR 标记;P：阳性对照；N：阴性对照；
1～3为阳性脑瘤标本；4～6为阴性脑瘤标本
图1 PCR产物2%琼脂糖电泳
四、PCR扩增产物斑点杂交
SV40 DNA特异寡核苷酸探针(5′-ATGTTGAGAGTCAGCAGTAGCC-3′)由Giblco公司合成，采用地高辛(digocigenin,DIG)末端标记。将PCR扩增产物加入斑点杂交点样器，点于硝酸纤维素膜上，真空泵抽干，80℃烘烤1 h，42℃预杂交2 h，加入新鲜变性探针杂交24 h，室温下充分洗膜，抗DIG碱性磷酸酶复合物(1∶5000)37℃1h，洗涤后用NBT和BCIP液在暗室中显色(图2)。
P：阳性对照；N：空白对照；1～10为脑瘤组织扩增产物阳性
图2 PCR产物斑点杂交
五、统计学处理方法
采用χ2检验。
结 果
人脑肿瘤组织516份中188份检测出SV40的DNA序列，阳性率36.4%。PCR 扩增产物的斑点杂交检测结果见表1。经统计学处理显示，人脑肿瘤组织标本中各种病理类型SV40 DNA序列检测阳性率差异无显著性(χ2＝5.163，P＞0.05)；其它正常组织标本检测结果见表2。健康人外周血及健康人精液之间阳性率差异不显著(χ2＝0.676，P＞0.05)，两者阳性率可合并；人胚胎组织与正常脑组织的阳性率之间差异也无显著性(χ2＝0.058，P＞0.05)，两者阳性率也可合并。χ2检验脑肿瘤阳性率与合并后各组织类型阳性率之间的差异均显著(P＜0.05)，结果见表3。SHG44、BT325两株细胞系中也分别检测出SV40的DNA序列。
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