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人内皮抑制素在酵母细胞中的表达及其促成纤维细胞有丝分裂活性 |
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可能成为很有前途的抗肿瘤 药 物。我们从人肝脏组织中分离出人Endostatin cDNA，在可高效表达GST融合蛋白的酵母表达 系统中表达出重组人Endostatin蛋白质，并采用小鼠NIH3T3成纤维细胞研究了其促有丝分裂 活性。
1 材料与方法
1.1 材料 TriZOL试剂，购自GIBCO/BRL公司；逆转录酶，RNasin，TaqDNA聚合酶 购自Promega 公司；YEXpressTMYeast表达系统购自美 国CLONTECH Laboratories；INC、pCRTM Ⅱ质粒购自Invitrogen、OligodT；菌种DH5α，INVαF本室保存；DNA重组所用的各种限制 酶，T4连接酶购自大连宝泰克公司；酶标驴抗兔抗体由本教研室提 供；NIH3T3细胞株由长春吉林大学惠赠；新鲜人肝脏组织来自于白求恩医科大学第一临床医 学院手术标本。
1.2 逆转录-PCR 用TriZOL试剂盒 从人新鲜肝脏组织中提取总 RN A，以Oligod T为引物将其逆转录为cDNA，再以PCR扩增出目的DNA片段。PCR所用引物是根 据人胶原XVⅢ的cDNA序列［2］设计而成，上游引物：5'-tatagaa ttcATGCACAGCCACCGCGACTTCC-3'；下游引物：5'-tatcgtcgacCTACTTGGGGCAGTCATG -3'由上海 Sangon公司合成，引物5'端携带有EcoRI及SalI酶切位点。常规PCR反应条件扩增目的cDNA 。
1.3 PCR产物的克隆 将PCR产物直接克隆入pCRTMⅡ质 粒，得到pCRTMⅡ-Endo重组质粒，克隆方法见文献［3］。
1.4 重组表达质粒(pYEXEndo)的构建 利用人Endostatin cDNA片 段内一偏心酶切位点PstI对目的cDNA片段进行酶切，初步鉴 定 其为Endostatin后，将人Endostatin片段定向次级克隆入pYEX4T-1真核表达质粒EcoRI及Sa lI酶切位点中，克隆方法见文献［4］ ，酶切鉴定筛选出阳性克隆。
1.5 序列测定 纯化重组质粒pYEXEn do，经宝泰克公司DNA序列自动分析仪进行序列分析。
1.6 目的基因的表达 依照说明书将pYEXEndo重组质粒转化入DY150酵母 细胞 中，并对阳性重组酵母细胞进行诱导表达，表达产物 按常规方法进行SDS-PAGE。
1.7 重组蛋白的Western印迹分析 由于重组蛋白为GST融合蛋白， 所以利用抗GST抗体可对重组蛋白做进一步鉴定。转膜及杂交方法见文献［4］。
1.8 重组蛋白的促有丝分裂活性测定 收集诱导表达的阳性克隆酵母细胞 ，并经超声裂解后，经PBS透析得到GSF Endostatin重组蛋白粗提物，以5×103/孔接种NI H3T3细胞于96孔板中0.5%血清IMDM培养过夜后，弃培养液，加入不同浓度的粗提表达产物， 继续培养16 h，加入MTT(0.2 mg/ml)，37C放置4 h，弃上清，加MTT溶解液(100 μl/ 孔)，37C温育2 h，测OD值。
2 结果
2.1 RT-PCR扩增人Endostatin cDNA及初步鉴定 以人肝脏组织总RNA为 模板，通过RT-PCR扩增得到PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。人Endostatin cDNA片段长 为549 bp，PCR产物长度与其基本一致。克隆得到pCRTMII-Endo重组质粒后，选择Endostatin cDN A片段内一偏心限制性内切酶酶切位点PstI进一步酶切，电泳后可见cDNA片段被切成大小为1 59和390两段，与报道一致，初步证实其为人Endostatin ，结果见图l。
图1 人内皮抑制素cDNA的PCR扩增及鉴定
Fig.1 Identification of amplified and digested RT-PCR products
Note:A.PCR product of Endostatin cDNA;l,Endostatin specific cD NA indicated by an arrow;2, DNA marker. B.l, DNA marker;2,pCRTMII-endo EcoRI,Psti; 3,pCRTMII-endo EcoRI
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