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补体C5b |
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l,MC)合成一氧化 氮(Nitric oxide,NO)［2］。然而，有关补体C5b-9复合物介导MC表达诱生性一氧化 氮合酶(Induc ible NO synthase,iNOS)及合成NO的作用少见报道，本文应用大鼠MC培养系统观察了C5b -9这一作用。
1 材料与方法
1.1 人血清补体C5b-9复合物的提取 方法参见文献［3］。提取后 的 C5b-9复合物除作电镜观察外，还经斑点-ELISA(Dot-ELISA)法用抗人C3、C5、C9及C5b- 9复合物抗体(美国DAKO公司)染色鉴定，方法参见文献［4］。
1.2 大鼠肾小球MC的培养与鉴定 具体步骤见文献［5］。
1.3 大鼠iNOS cDNA探针的制备 大鼠iNOS cDNA的重组质粒由瑞士Novar tis公司移植研究室薛春博士惠赠。采用地高辛(Digoxigenin,DIG)RNA标记试剂盒(SP6/T7 ，德国B.M公司)制备cRNA探针方法详见文献［6］。
1.4 培养大鼠肾MC的分组处理 将传代培养1 w的肾MC营养液换成不含 酚红 的RPMI1640并添加10%小牛血清及1 mmol/L精氨酸继续培养24 h。然后将各瓶培养的MC作如 下 分组处理，C5b-9组：应用人C5b-9复合物刺激MC，终浓度为40 μg/ml营养液；C5b-9+a nti- C5b-9组：先加入与C5b-9相同剂量的人C5b-9复合物，随后加入抗人 C5b-9复合物单克 隆抗体， 剂量为20 μl/ml营养液；C5b-9+actinomycin D组：先加入人 C5b-9复合物(剂量同前)， 接 着加入放线菌素D(德国BIB公司)，终浓度为0.05 μg/ml营养液；对照组：仅加营养液 培养。
1.5 MC总RNA的提取 应用TRIZOL试剂(美国GIBCO公司)提取各组MC在分 组 处理后3、6、24及48 h细胞总RNA，并作1%琼脂糖甲醛变性胶电泳鉴定。另用RNA markerⅡ( B.M公司)作为参照物。
1.6 MC iNOS mRNA的检测
1.6.1 斑点杂交(Dot-blot) 分别取人C5b-9复合物刺激3、6、24及48 h 后 提取的MC总RNA各10 μg点样加在尼龙膜上，用DIG-cRNA iNOS 探针进行杂交，然后 用DIG核苷酸检测试剂盒(B.M 公司)显色观察。
1.6.2 膜杂交(Northern blot) 分别取不同处理的各组MC 24 h提取的 总RNA电泳后，再转至尼龙膜上，其余按Dot-blot法检测。
1.7 MC培养液中NO3-/NO2-含量的测定 采用硝酸还原酶 法测定 不同处理的各组MC经3、6、24及48 h培养后上清液中的NO3-/NO2-的含量， 方法按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。
2 结果
2.1 人C5b-9复合物的提取与鉴定 提取的人补体C5b-9复合物电镜负染 多呈 空心环状结构，与国外文献报道一致。Dot-ELISA鉴定显示：抗人C5、抗 C9及C5b-9复合物 抗体染色呈现阳性，而抗人C3染色呈现阴性。
2.2 大鼠肾MC的培养与鉴定 原代培养2 w的MC细胞多呈梭状或星形。 传代 的细胞生长极快，1 w 后细胞形态趋向一致，伴有不规则突起。免疫组化染色显示，生 长的细胞为纯度极高的肾小球MC。
2.3 大鼠iNOS cRNA探针的敏感性 质粒按常规方法扩增、提取、酶切及 标记等步骤制备的大鼠iNOS cRNA探针，其敏感性可达0.1 pg/μl。
2.4 大鼠MC总RNA的电泳结果 提取的各组大鼠MC总RNA电泳结果见图1。
2.5 点杂交与膜杂交检测结果 Dot-blot检测显示：培养的MC经C5b-9 复合物 刺激3 h后即可见iNOS mRNA表达，但表达量较低。刺激6 h时iNOS mRNA表达明显增加，24 和 48 h时表达十分显著(图2)。Northern blot检测的结果表明(图3)：C5b-9组的MC 24 h时iN OS mRNA 明 显表达， C5b-9+anti-C5b-9组及C5b-9+actinomycin D组iNOS表达量均明显减少，对照 组未见iNOS mRNA的表达 (注 iNOS mRNA其大小在4.5 kb左右)。
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