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噬菌体表面呈现抗人红细胞血型A抗原单链抗体的研究 |
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oup ABO substance
噬菌体表面呈现技术(Phage display technology,PDT)是利用在改构的噬菌 体 外壳蛋白质基因PIII或PVIII区引入外源基因，以融合形式表达外源肽或蛋白，使其随着 噬 菌体的组装而呈现在噬菌体表面，保持特定的空间构象，并通过免疫亲和吸附法筛选特异性 肽或蛋白的一项新技术［1］。它的出现极大地推动了抗体工程的发展，为在体外 模拟免疫系统的抗原选择和抗体多样化过程，进而筛选高特异性、高亲和力的基因工程抗体 提 供了技术支持。本实验在已完成杂交瘤建株、分离抗体可变区基因等工作的基础上［2 ，3］，采用噬菌体表面呈现技术，构建了抗人红细胞血型A抗原杂交瘤50A株噬 菌体单链抗体库，为研制第三代基因工程原核血型检定抗体试剂奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 细胞和载体 小鼠杂交瘤细胞系50A由本室研制，分泌抗A单克隆抗体 ，为IgM类；E.coli HB2151、E.coli XL-Blue和含(Glu4Ser)3接头质粒pSTE-215为 德国Duble教授惠赠；测序用T-Vector easy Kit 购自Promega公司；噬菌体抗体表达载体p CANTAB5E和辅助噬菌体M13KO7购自Pharmacia公司。
1.2 工具酶和试剂 限制性核酸内切酶为Biolabs产品；T4 DNA连接酶、 IPTG、碱性磷酸酶为Promega公司产品；PCR Kit为上海Sangon生物工程公司产品；正常人分 离 红细胞由南京军区总医院提供；酶标抗E-tag抗体、鼠抗噬菌体衣壳蛋白抗体为Pharmacia 公 司产品；HRP标记兔抗鼠IgG抗体及DAB显色液为SABC产品。其余试剂均为分析纯级(A、R)或 分子生物学纯级。
1.3 PCR引物设计与合成 参考已知的小鼠抗体轻、重链可变区氨基酸序列 ，设计合成了抗体可变区5’端及3’端引物。用于扩增重链可变区的一对引物为VH Back 和VH For,用于扩增轻链可变区的一对引物为VL Back和VL For，引入连接肽编码基 因用于拼接PCR构建50A单链抗体基因的一对引物为Linker For和Linker Back,用于加端PCR 引入与pCANTAB5E克隆位点SfiI、NotI匹配的一对引物为VHO和VLO。引物序列如下：
以上引物由上海Sangon生物工程公司帮助合成纯化。
1.4 50A单链抗体基因的构建［3］ ①VH和VL基因克隆：收 集对数生长期杂交瘤细胞，异硫氰酸胍一步法［4］提取细胞总mRNA，逆转录合成cDN A第一链。用鼠源抗体引物(VH Back/VH For,VLBack/VLFor)从cDNA中分别PCR扩增 VH和VL基因，Microspin柱纯化扩增产物。②连接肽编码基因的克隆：以Linker Fo r和Linker Back为引物，含Linker质粒pSTE-215为模板，常规PCR克隆连接肽编码基因。③ 拼接PCR组装ScFv基因：在75 μl反应体系中，含纯化的VH、VL和十五肽接头基因各 20 ng，1.0 mmol/L dNTPs，2.0 mmol/L MgCl2，5 U Taq DNA多聚酶，混匀后进入拼接 循 环，条件为：95℃变性45 s，62℃退火2.5 min，72℃延伸1 min，共扩增8个循环；在反 应体系中加VHO和VLO引物各50 pmol, 5 U Taq DNA多聚酶的混合溶液25 μl，进入二 级 循环：94℃变性50 s，56℃退火1.5 min，72℃延伸1.5 min，共25个循环。拼接PCR反 应后，组装的ScFv基因5’、3’端分别加上与pCANTAB5E载体匹配的NcoI(NcoI与 SfiI具有 相匹配的粘性末端)及NotI酶切位点。
1.5 噬菌体单链抗体库的构建 将纯化的ScFv片段依次用NcoI/NotI酶切 ，M icrospin柱纯化，在T4 DNA连接酶作用下，定向插入pCANTAB5E表达载体(图1)，常规CaCl 2法转化E.coli XL-1 Blue感受细胞，氨苄抗性丰富培养基培养转化细胞至OD600=0. 5，加入 总滴度约3×109pfu M13KO7辅助噬菌体援救，构建噬菌体抗体库，涂板测定抗体库滴度。
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