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小鼠白细胞介素 |
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的一种能够诱导IFNγ大量分泌表达的细胞因子［1-3］。初步的研究结果表明，丙酸杆菌感染引起的感染性 休克中，肝脏的枯否氏细胞是表达IL-18的主要细胞类型，而且这种IL-18的基因表达不受 细菌脂多糖刺激的影响［4］。由于近年来认识到IFNγ在免疫调节中，特别是对Th1 细胞发育和机体感染过程中具有十分重要的作用，因此，认为IL-18的研究也具有重要的意 义［5］。我们根据已发表的小鼠IL-18的cDNA序列［6］，设计合成小鼠IL -18基因特异性的引物，以小鼠脾mRNA为模板，应用逆转录多聚酶链反应技术，获得了全长 的小鼠IL-18基因克隆，并实现了在小鼠成纤维细胞中的初步表达。
1 材料与方法
1.1 小鼠脾细胞的制备与总RNA的提取 取健康6周龄的Balb/c小鼠1只， 无菌条件下取出 脾脏，剪碎，以毛玻璃片研磨，使之成为单细胞悬液，加入2倍体积的不含胎牛血清的RPMI 16 40培养基洗涤1次，离心5 min，小鼠脾组织中的不溶性结缔组织即粘附在试管或吸管壁上。 以含有氯化氨(0.144 mol/L NH4Cl， 0.017 mol/L Tris-HCl)的红细胞裂解液裂解红细 胞15 min。以 不含胎牛血清的细胞培养基RPMI 1640洗涤细胞2次将脾细胞浓度调整为1×106ml-1 ，在5% CO2，37C的条件下培养60min。取非粘附细胞，将细胞浓度调整到5×105ml-1 ，以含有 10 μg/ml PHA 和1 μg/ml LPS 的完全RPMI1640培养基进行培养和刺激12 h。收集细胞， 以异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA［7，8］。
1.2 逆转录多聚酶链反应扩增 有义链引物：5’-ATG G CT ACC ATG TCA GAA GAC TC -3’，反义链引物：5’-CTA ACT TTG ATG TAA GTT AGT G-3’。参照Gibco/BRL 试剂盒 说明书，以总RNA 为模板进行逆转录合成cDNA 的第1条链，以Taq多聚酶进行PCR扩增。扩 增的条件为94C 3 min，(94C 30 s+58C 30 s+70C 30 s)25个循环，70C 10 min，反应体积为100 μl。
1.3 RT-PCR扩增产物 以1.2%的琼脂糖凝胶电泳，收取0.5 kb大小的基 因片段，以HB101公司 的玻璃牛奶(Glassmilk)试剂盒对基因片段进行纯化。将纯化的基因片段克隆到Invitroge n 公司的载体pTOPO中，所有操作均按照试剂盒有关的操作说明书进行。选择阳性克隆，以ABI 公司的自动测序仪对克隆的片段进行双向测序分析。
1.4 mIL-18真核表达载体的构建 重组TOPO载体以限制性内切酶EcoRI、XbaI进行消化，以释出带有合适粘性末端的小鼠IL -18的编码基因片段，以同样的限制性内切酶消化真核表达载体pcDNA3(购自美国Invitroge n公司)，将mIL-18的基因片段定向克隆到相应位点上。所有操作均按照分子克隆手册有关 的方法进行［9］。
1.5 mIL-18在小鼠成纤维细胞系SVT2中的表达和活性测定 以8 μg的pc DNA3-mIL-18 质粒DNA，以脂质体(lipofectin)方法，转染小鼠成纤细胞系SVT2，以新霉素的类似物G418 进行筛选，获得G418抗性细胞克隆。转染细胞培养上清中的mIL-18的生物学活性，按照Oka mura等的诱导IFNγ产生能力测定方法进行［6］。
2 结果
2.1 RT-PCR对mIL-18的扩增结果 以经过植物血凝素PHA和细菌脂多糖LPS刺激的小鼠脾细胞来源的总RNA逆转录物为模板，以 有义链和反义链两段引物进行的PCR扩增，获得500bp大小的基因片段，如图1所示。
2.2 mIL-18的核苷酸序列 应用RT-PCR技术，从小鼠脾细胞mRNA扩增获得的mIL-18的基因序列，与文献报道的mIL-1 8的核苷系列完全一致。小鼠
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