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羌族人群成人多囊肾病PKD1基因SM6位点的多态性研究 |
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敬慧娥 张思仲 丁兰
中华民族基因组计划(Chinese genome project)主要致力于民族基因组多态性的保存和研究。在人类基因组多态中，微卫星DNA的多态性近年来尤其受到研究者的关注。微卫星(microsatellite)DNA是由2至数个碱基作为核心单位，串联重复形成的一类DNA序列，由于核心重复序列拷贝数的变化构成了微卫星基因座位高度的遗传多态性，是极好的遗传标记。在不同人群中微卫星的等位片段种类及频率分布可能有差异，这些差异可能代表某一种族或人群的特征，反映不同人群间的遗传差异。因而微卫星DNA在人类基因定位、遗传病的连锁诊断以及法医学亲权鉴定中具有重要的运用价值；再者还可用于人类群体遗传学的研究，以了解人类群体的基因流动及遗传差异。
SM6是16号染色体短臂(16p)特异的微卫星DNA，位于成人多囊肾病(adult polycystic kindney disease,APKD)基因PKD1上游，其多态序列由3个二核苷酸重复序列组成，结构为(TG)n1 C(CG)n2TGC(CA)n3［1］。有作者报道SM6位点在中国汉族人群中具有高度的多态性，其等位片段的分布具有明显的民族差异［2］。我们采用PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染等技术，对60例无亲缘关系的羌族正常个体SM6位点重复序列进行了研究，获得了该多态位点在羌族人群中的等位基因和频率分布，并与汉族人群的资料进行了比较。
图1 部分羌族个体SM6区域PCR扩增结果 羌族人群中SM6等位片段有：124，122，120，116，114，112，106，96和90bp，分子量标记M1为pBR322／Msp1,分子量标记M2为pBR322／Hae Ⅲ 图2 羌族汉族人群SM6重复序列分布直方图
1 材料和方法
1.1 材料来源 60例羌族正常个体为四川省茂县民族中学学生。皆经过严格的问询及填表，以确认被检者身体健康和3代之间为同族婚配。抽外周血，DNA标本按
1.2 寡核苷酸引物参照文献［1］序列，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成，序列为：5′-AGCTGGGGTCTCAGGGG-
AGCT-3′；5′-GCGCACACAGCACTAA-
CACG-3′。
1.3 PCR扩增 PCR扩增按常规方法，在PE公司TC-1型热循环仪上进行。反应总体积为25μl，内含：1×PCR Buffer,200μmol/L dNTP,引物各0.3μmol/L，20～100ng模板DNA，ddH2 17.5μl，耐热Taq DNA聚合酶0.5U，混匀后覆盖30μl矿物油。96℃预变性8分钟，循环条件为94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 30秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。为PCR反应系统设置了阴性对照，即反应系统中模板DNA以灭菌超纯水代替。
1.4 PCR产物的检测 将PCR产物2～5μl点样于10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(19∶1)，电压20～300V，电流10～20mA，电泳2小时后，再按本室常规方法银染显示电泳结果并照像记录。
1.5 PCR产物分子量的估算 测定各带的电泳距离，参照分子量大小标记(pBR322／Hae Ⅲ和pBR322／Msp1)各带的位置，进行估算。其大小用碱基对数(bp)直接表示。
2 结果
对60名羌族正常个体SM6位点分析结果，共发现10个等位片段，其大小在90～124bp之间。各等位片段经目测和分子量估算，估计其大小分别为90、96、100、106、112、114、116、120、122和124bp(图1)。
统计各等位片段的数目及频率表明(表1)：正常羌族人群中SM6为122bp
表1 中国羌族人群PKD1基因上游SM6等位片段的分布
等位基因
(bp) 染色体
数目 等位片段
频率fi(%) (fi)2 纯合子数目
(预期值)
124 19 15.83 0.02600 3(2)
122 73 60.83 0.38000 26(24)
120 2 1.67 0.00028 0(0)
116 4 3.33 0.00110 0(0)
114 11 9.17 0.008[1] [2] 下一页
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