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铅的神经细胞发育毒性与谷胱甘肽水平的关系 |
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SD大鼠，体重200～250 g，雌雄1∶1合笼，次日清晨检查阴栓，见栓之日定为妊娠0 d。
4.大鼠胚胎中脑神经细胞的制备：采用Flint中脑微团培养法［1］，颈椎脱臼法处死妊娠13 d的SD孕鼠，取出子宫，剥离全部胚胎(34～36个体节)，切取中脑，置于0.5％胰蛋白酶/PBS消化液中，37℃孵育约25 min。吸弃消化液，再加入完全培养液，用吸管吹打使之成为细胞悬液后，调整细胞密度为5×106/ml。培养当天计为0 d，此后依次为1～5 d。
5.细胞毒性实验：96孔培养板每孔接种10 μl细胞悬液，置CO2培养箱中(5％CO2/95％空气，100％相对湿度)孵育2.5 h，待细胞贴壁后每孔加200 μl完全培养液继续培养1 d，换含不同浓度醋酸铅的新鲜培养液200 μl染毒4 d。利用MTT法检测细胞存活情况［2］。
6.细胞分化试验［2］：24孔培养板每孔接种20 μl细胞悬液，置CO2培养箱中孵育2.5 h以使细胞贴壁，然后每孔加1 ml完全培养液继续培养1 d后，换含不同浓度醋酸铅的培养液染毒，4 d后进行苏木精染色。在实体显微镜下计数集落。
7.细胞内谷胱甘肽(GSH)含量检测及N-乙酰半胱氨酸(NAC)的拮抗实验：细胞接种于24孔板，分别作4种处理：①对照组，②醋酸铅染毒组，③NAC单独处理组，④醋酸铅+NAC处理组。首先，②、④组加入含不同剂量醋酸铅的培养液染毒，1 d后终止，用PBS洗3遍。然后，③、④组换含1 mmol/L NAC的培养液，①、②组则换空白培养液继续培养。于培养2和5 d，用细胞刮刮取细胞，离心去上清，于磷酸钠-EDTA偏磷酸缓冲液中超声粉碎细胞，用荧光法分别检测细胞的GSH含量［3］，同时用考马斯亮蓝法检测各组细胞的蛋白含量［4］。GSH含量以nmol/mg蛋白表示。第5天同时检测各组的细胞毒性及分化情况。
8.统计分析方法：用SAS软件对数据进行细胞存活半数抑制浓度和半数分化抑制浓度分析。用SPSS软件进行t检验、多因素方差分析和相关分析。
结果
1.铅对细胞存活和分化的影响（表1）：不同浓度的醋酸铅染毒后，均可抑制细胞的存活，且有明显的剂量-效应关系(r=-0.86, P＜0.05)，其细胞存活半数抑制浓度为3.69 μmol/L，95％可信区间为2.00～7.06 μmol/L。不同浓度的醋酸铅染毒4 d后，均可抑制细胞的分化，并呈现明显的剂量-效应关系（r=-0.920 4，P＜0.01），半数分化抑制浓度为1.03 μmol/L，95％可信区间为0.90～1.18 μmol/L。
2.铅对神经细胞内GSH含量的影响及NAC的拮抗作用（表2～4）：1 mmol/L NAC本身可促进细胞的增殖，并可明显提高各剂量组细胞的存活率，与单加醋酸铅组相比差异有显著性。NAC本身对细胞的分化无明显影响，但可明显增加各剂量组的分化率，与单加醋酸铅组相比差异有显著性，相比之下分化率较存活率增加的更明显。醋酸铅可导致细胞
表1 铅对大鼠胚胎神经细胞存活及分化的影响(n=3，±s)
染毒剂量
(μmol/L) 细胞存活 分化
吸光度值 存活率(％) 集落数 分化率(％)
0.00
0.91±0.08
100.0
225.3±3.6
100.0
0.25 0.88±0.05 96.7 203.0±4.7* 90.1
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