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金属硫蛋白对 射线和丝裂霉素C致遗传损伤的拮抗作用 |
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形成和DNA链断裂是否有拮抗作用而进行本试验。
材料与方法
1.小鼠骨髓微核试验：昆明种雄性小鼠(北京医科大学实验动物部),18～22g,分为5组,每组6～8只。MT实验组连续灌胃不同剂量Zn-MT(北京大学生化和分子生物学系提供)7天。于第7天除阴性对照组外以5.0Gy 60 Co-γ射线照射各组小鼠,剂量率为1.2862Gy/min(北京医科大学钴源室提供)。24小时后处死,按常规进行骨髓微核试验。
2.g12细胞双核微核试验：g12细胞(纽约大学医学中心CatherineB Klein馈赠)贴壁培养4小时后,加入不同剂量的Zn-MT,继续培养20小时。然后按设定剂量进行 60 Co-γ射线照射，或换以含不同浓度MMC(Kyowa产品)的Hank溶液,37℃,染毒3小时。染毒终止后,用PBS洗去瓶中残存的MMC。将上述处理过的细胞再换以含6μg/ml细胞松弛素B(Sigma)和原Zn-MT浓度的F12生长液,继续培养20小时。最后将细胞用胰酶消化，0.075mol/LKCl、37℃低渗处理4分钟,甲醇/冰醋酸固定,滴片,染色,镜检。每剂量处理2瓶细胞,每瓶观察记数1000个双核细胞中含1、2个或多于2个微核的细胞数,以计算双核微核细胞率及抑制率。
3.g12细胞单细胞凝胶电泳：g12细胞在含或不含Zn-MT的F12生长液中培养20小时后，进行1Gy60Co-γ照射。照射后立即收集单细胞悬液，按罗瑛等［3］方法制备琼脂糖凝胶板。将胶板置于细胞裂解液中(pH值10)，4℃裂解1小时，再于4℃电泳20分钟(25V,300mA)。最后胶板经中和，碘化丙啶(5μg/ml)染色，再在荧光显微镜下镜检。绿光激发，吸收滤片为590nm。每一剂量测量50个细胞的头长及全长，观察其中拖尾细胞出现率，计算核DNA平均迁移距离(既尾长)及拖尾细胞频率。
4.统计学处理：微核率及拖尾细胞频率用χ2检验，迁移距离用t检验。
结果
1.Zn-MT对γ射线照射后小鼠骨髓微核形成的影响：照射前6天和照射后1天连续给以Zn-MT，高剂量(664μg/kg体重)Zn-MT能有效抑制5.0Gy60Co-γ照射诱发的小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核率和微核细胞率升高（P<0.05），微核细胞抑制率达23.8%。其他剂量对γ射线诱发的微核无抑制作用(表1)。
表1 兔肝锌金属硫蛋白对照射后小鼠骨髓微核形成的影响(±s)
剂量 嗜多染红
细胞数 微核细胞率(‰） 微核率(‰）
γ射线
(Gy) 锌金属硫
蛋白(μg/kg)
0 0 7000 1.40± 1.00
1.40± 1.00
5 0 8000 38.38±8.59 42.00±10.43
5 116 6000 39.67±15.96 44.17±18.39
5 332 7000 38.14±11.13 42.00±13.63
5 664 8000 29.25±4.71* 32.63±5.58
*与单纯照射比P<0.05
2．Zn-MT对γ射线诱发g12细胞双核微核形成的影响：60Co-γ照射引起g12细胞含微核的双核细胞率与含2个以上微核的双核细胞的比例随照射剂量增加而增高（P<0.01）。Zn-MT能显著降低γ射线诱发的双核微核细胞率（P<0.01）和多核微核细胞（P<0.01）和多微核双核细胞的比例。其抑制率随Zn-MT浓度增加而升高，10μg/mlZn-MT对1和3Gy的双核微核细胞抑制率分别为42%和35%，50μg/ml时分别达56%和52%（表2）。
表2 兔肝锌金属硫蛋白对γ射线诱发g12细胞双核微核形成的影响
γ射线
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