|
伴有低外显率的Rb基因点突变及其特征和意义 |
| |
b基因突变分析的基础上，发现RB的低外显率并不是完全随机的，除了与我们曾经报道过的突变嵌合体有关外［4］，还与以下几种Rb基因突变存在密切联系。
1 材料与方法
1.1 DNA样品 收集RB患者的肿瘤与外周血、RB患者家庭成员的外周血，健康成年人的外周血，按标准方法提取肿瘤及白细胞DNA。
1.2 SSCP分析 用于SSCP分析的DNA片段包括外显子及其旁侧20～50bp的核苷酸顺序。引物的设计参照已发表的Rb基因序列资料［5］。PCR反应在50μl的反应体积中进行，包括标准缓冲液(20mmol／L
Tris-HCl pH8.4或8.6、1.0～2.5mmol/L MgCl2、50mmol/L KCl、50μg/ml BSA),20μmol/L dATP,dGTP，dTTP及2μmol/LdCTP,0.5U Taq DNA聚合酶。50ng的肿瘤或白细胞DNA，1μl 20pmol/L引物和0.1μl 740kBq/ml α32P dCTP。94℃变性1分钟、45～60℃退火1分钟、72℃延伸2分钟，共30个周期。对大于200bp的PCR产物先用适当的限制性内切酶消化，使之酶解成2～3个片段。PCR产物经94℃变性后分别走二块9%(30∶1)的聚丙烯酰胺凝胶，其中一块含10%的甘油。电泳完毕后真空干燥凝胶，室温放射自显影［6］。
1.3 DNA序列分析 用于序列分析的DNA片段较SSCP分析片段大50～100bp。选择较大的DNA片段作为模板，目的在于清楚显示SSCP分析时所观察到的各种变异。PCR反应条件同SSCP分析。扩增后的PCR产物经蛋白酶K消化，酚∶氯仿抽提，过Sepharose CL-6B柱，乙醇沉淀。序列分析引物用T4多核苷酸激酶及γ-32P ATP作末端标记，链终止反应在1∶10的dNTP/ddNTP中由0.3U的DNA Sequenase Version 2催化完成。反应完毕后94℃变性，走含有8mol尿素的聚丙烯酰胺凝胶；真空干燥凝胶后室温放射自显影［6］．
2 结果
研究的病例显示以下几种特殊类型的Rb基因点突变与RB低外显率存在密切联系。
2.1 Rb基因Arg661→Trp661突变 5个低外显率的RB家系共同存在Rb基因第20号外显子661位密码子处C→T的突变，造成原编码的精氨酸突变为色氨酸。典型病例见家系1，其中2个尚存活的单眼RB患者(Ⅲ1、Ⅲ8)和9个表型完全正常的个体(Ⅱ1、Ⅱ2～6、Ⅲ9、Ⅲ13、Ⅲ14)其白细胞DNA中均存在杂合性Arg661→Trp661突变(图1和图2A、2B)。
图1 家系1图谱 其中Ⅱ1～6、Ⅲ1～4，8～14有外周血DNA可供Rb基因点突变分析，Ⅲ1、6、8为单眼RB患者；Rb：为正常等位基因，rb：为突变等位基因
Fig 1 Pedigree of RB family 1 The WBC DNA were available for analysis of Rb gene mutation from Ⅱ1-6 and Ⅲ1-4，8-14
图2 家系1Rb基因20号外显子SSCP与DNA序列分析 A表明家系中Ⅱ1～6及Ⅲ1、8、9、13、14，Rb基因第20号外显子存在变异；B为DNA序列分析证实该变异为Rb基因第20号外显子661密码处C→T突变，导致Arg突变成Trp
Fig 2 SSCP and DNA sequencing analysis of Rb gene exon 20 A: showed variant bands in WBC DNA from Ⅱ1-6, and Ⅲ1,8,9,13,14； B: Sequence analysis showed the variant was C to T transition at codon 611 resulting Arg to Trp
2.2 Rb基因外显子与内含子拼接位点异常 2个低外显率RB家系存在拼接位点的突变。家系2先证者
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 重组PCR构建bcr
下一个医学论文： 野慈姑自然群体异交率的定量估测
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文