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PCR |
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bove results suggest that this assay can become an effective measure in the detection of ALL-MRD clinically.
【Key words】 Polymerase chain reaction Gamma T-cell receptor gene rearrangement Minimal residual disease Acute lymphoblastic leukemia
目前，在急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留病(MRD)的检测中，常以免疫球蛋白或T细胞受体基因的克隆性重排作为标志基因，我们选用T细胞受体γ链基因重排(TCRγ)作标志基因，采用PCR-RNA转录本分子杂交法检测ALL-MRD，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞系和患者标本 SUP-B7细胞系细胞，来自
1例CALL患者的白血病细胞，含有TCRγ基因重排［1］。例1为6岁女性ALL患儿，FAB分型为L1，免疫分型为非T-Ⅲ型，其DNA标本分别取自患者确诊时和完全缓解期(CR)骨髓。
1.2 聚合酶链反应(PCR) 反应体系50μl，模板DNA(苯酚抽提)0.5～1.0μg，每种引物25pmol，引物序列为：(1)扩增探针标本引物：P1为5′GCTAATAC-
GACTCACTATGGGAGAGACAACAAGTGTTGT-
TCCAC；P2为5′CGGCTACATCCACTGGTACCT。(2)扩增待测标本引物：T1为5′GCTAATACGACTC-
ACTATGGGAGACGGCTACATCCACTGGTACCT；T2为5′GTTCCACTGCCAAAGAGTTTCTT。Taq DNA聚合酶2U，4×dNTP终浓度各100μmol/L。每轮扩增为94℃ 60秒(第1轮240秒)，60℃ 120秒，70℃90秒(最后1轮360秒)，共30轮。每份PCR产物用2%琼脂糖电泳时可见一预知大小的单一条带为阳性结果。
1.3 体外转录 转录体系50μl，PCR产物6μl作模板，T7 RNA聚合酶50U，各自终浓度为4mmol/L的4种单核苷酸，转录放射标记的探针时用74mBq/ml(2mCi/ml)α-32P-UTP代替普通的UTP，RNasin 10U。上述混合液在37℃水浴中孵育15分钟，再经RNase-free DNase I 1U(Life Technologies公司)消化以去除模板DNA。上述转录本经苯酚抽提、无水乙醇沉淀后重溶于80μl杂交缓冲液中。
1.4 RNA转录本分子杂交及RNase A消化 探针RNA与相应的待测RNA以1∶9的比例在总体积40μl的杂交缓冲液中杂交。杂交混合物经95℃10分钟后转入64℃水浴中孵育过夜。次日加入40μg／ml RNase A300μl，42～50℃水浴中消化30分钟；随后加入10% SDS 20μl以终止消化。
1.5 放射自显影 杂交产物经含7.6mol／L尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶(PAG)电泳。电泳后的PAG经冰乙酸固定后置X光胶片在-20℃曝光过夜。
2 结果
2.1 实验原理 如图1所示，我们所用2对引物P1P2和T1T2分别互补于TCRγ重排基因内相差13个碱基的保守序列［2］，其PCR产物分别被转录成放射标记的RNA探针和未标记的RNA待测分子。在两对引物中，P1和T1分别在5′端带有T7 RNA聚合酶启动子［3］，目的是使两份PCR产物在转录时分别以互补的两条DNA单链为模板，其结果是转录成互补的两个RNA转录本。如引物P1P2和T1T2扩增的是SUP-B7细胞系TCRγ重排基因，则其PCR产物的分子量分别是281bp和268bp，其相应的转录本分别为263bp和250bp。如果待测标本中存在来自探针标本的特异性重排基因，那么探针和待测RNA杂交后形成的精确配对的RNA双链能抵抗RNase A的消化，电泳后未被消化的探针分子量为244bp(探针5′突出的19bp单链被消化了)；如果待测标本中不含探针标本中的特异性重排基因，则杂交后的RNA双链因存在不完全配对而被RNase A消化断裂，电泳后则只能看到分子量更小的探针片段。
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