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孕妇外周血胎儿有核红细胞的分离与检测 |
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鉴定其来源的方法过去常用胎儿血红蛋白(HbF)特异染色或细胞核型分析检测Y-小体等，这些方法费时且影响因素较多。我们采用流式细胞术和红细胞特异单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)GPA，试图从孕妇外周血中分离纯化胎儿NRBCs，并用分子生物学方法鉴定其来源。
1 材料与方法
1.1 检测对象 受试者3例妊娠16～24周，来自本院计划生育病房准备引产的孕妇；2例男性胎儿脐血(阳性对照)。
1.2 方法
1.2.1 标本制备 在引产前抽取孕妇前臂静脉血10ml置于2ml抗凝剂中。常法分离单个核细胞。直接荧光染色法：调整细胞数为5×106／ml，1∶16稀释的抗人GPAMcAb-FITC (Sigma公司产品，为鼠IgM独特型，自行热标法标记FITC)［2］。冰上孵育30分钟，冷PBS 4℃洗两遍，重悬于2ml pH7.4 0.01mol/L含2%BSA的PBS稀释液中，过滤，同时作空白对照和未孕妇女的阴性对照。
1.2.2 流式细胞术分选GPA阳性细胞 流式细胞仪FACS 440型(美国BD公司产品)，为氩离子单激光管，功率为200mV，激发光波长为488nm蓝光，FITC的发射光波长为530±20nm。样品测试之前，先用直径为10μm的标准彩色微球整定仪器工作范围。在设定的阈值内收集一定量细胞，分析其前相角(FSC)的细胞大小、侧相角(SSC)的细胞颗粒及荧光强度等参数，全部输入计算机，经Lysys Ⅱ软件分析处理。GPA阳性细胞和无荧光的阴性细胞被物理的分离。分选出的细胞收集到3ml无菌塑料管中，2份男胎脐血和3份孕妇的标本分别分选出GPA阳性细胞60 000～100 000个，其中一份脐血分选出100 000个GPA+细胞后，再分选出20 000个GPA+的细胞用作分选细胞的纯度分析。每份标本分两份，处理后-70℃保存。
1.2.3 分选出NRBCs鉴定 (1)细胞荧光原位杂交，按文献［3］采用非放射性的生物素标记法进行(生物素标记的PY3.4探针及杂交试剂购于北京医科大学人民医院血研所分子生物学实验室)；(2)对分选细胞PCR检测SRY特异序列，参考Bianchi［4］法进行，将分选细胞从-70℃冰箱中取出，37℃水浴融化，煮沸细胞悬液10分钟，迅速插入冰中。10 000r／min离心3分钟，上清即可用作PCR模板。总反应体积30μl，循环条件为：94℃变性60秒，55℃退火60秒，72℃延伸60秒，35个循环。最后一个循环后72℃再延伸5分钟。同时加作阳性、阴性对照及内参照(人β-珠蛋白引物)。取10μl扩增产物点样于1.5%琼脂糖凝胶EB(溴化乙锭)电泳，紫外灯下观察结果并照相记录。
2 结果
两例男胎脐血GPA阳性细胞百分率为20.56%和23.29%，分别分选出了105个GPA阳性细胞；3例孕妇血GPA阳性细胞百分率为2.54、2.39和3.94，分别分选出 8.4×104、6.3×104、1×105个候选细胞；未孕妇女阴性对照GPA细胞阳性率为0.62%，空白对照为0.08%。分选纯度达到99.7%。
2.1 FISH结果分析 杂交阳性细胞，其核被PI染成红色，核的边缘有一个明亮的黄绿色的杂交信号；阴性细胞，未见PY3.4杂交信号。3例孕妇标本PY3.4探针的FISH结果见附表和图1～3。
2.2 对3例孕妇分选出的NRBCs用直接细胞煮沸法［1］扩增SRY特异序列，只需一次扩增35个循环，1号及3号标本可见明显的271bp SRY特异扩增带，引产后证实怀有男性胎儿，2号未扩增出SRY特异序列，引产后证实怀有女胎，见图4。FISH杂交和PCR法鉴定结果完全相同。
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