|
CKIs蛋白在视黄酸诱导HL |
| |
E）对HL-60细胞细胞周期调控蛋白cyclinD1、p16、p21及抑癌基因表达产物pRb的影响，旨在深入探讨RA抑制细胞增殖、诱导细胞分化的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料 HL-60细胞株（人早幼粒白血病细胞）由北京医科大学血液病研究所提供，全反式视黄酸（All-tran retinoic acid，ATRA）为Sigma公司产物，芳香型维甲乙酯（简称芳维甲，Arotinoid ethylester，AE）由本校新桥医院皮肤科何威博士提供，鼠抗CyclinD1、兔抗pRb、兔抗p16INK4a、兔抗p21等单抗为Santa cruz公司产品，SP试剂盒为Zymed公司产品、PVDF膜和化学发光检测试剂盒为美国杜邦公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞株的培养及处理：HL-60细胞在含10％热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养传代。ATRA和AE分别溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配成5×10－3mol／L储存液置－20°C冰箱，处理细胞终浓度为5×10－6mol／L，对照组培养液中仅加相应量的DMSO（0．1％）。
1.2.2 细胞周期分析：经ATRA和AE处理1～4d的HL-60细胞、碘化丙啶染色后用流式细胞仪（FCM）对DNA进行定量分析，再结合计算机软件推算出各细胞周期相细胞所占比例。
1.2.3 细胞分化实验：NBT还原反应参照Kiziki等人的方法［3］。
1.2.4 Western blot分析：1×107个经ATRA和AE分别处理不同时相的HL-60细胞中加入100 μl 1％ NP-40细胞裂解液（50mmol／L Tris，150mmol／L NaCl，1％ NP-40，5mmol／L NaF，5mmol／L Na3VO4，5mmol／L Na4P2O7，0．1％ SDS，1mmol／L PMSF，10 μg／ml Leupetin，10 μg／ml Aprotinin），冰浴 30min、4°C 12 000g×2min，上清保存于－20°C备用（为蛋白质粗提物）；参照《分子克隆》第2版［4］，取细胞蛋白粗提物20 μl经10％ SDS-PAGE电泳后，用电转移转膜，1％ BSA 37°C封闭1h或4°C封阻过夜，加一抗，37°C孵育1h，再与生物素标记二抗及链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶复合物37°C反应1h，最后再用化学发光检测试剂盒检测相应蛋白带。
1.2.5 免疫细胞化学染色：参见文献方法［5］。细胞经固定、封闭后加一抗37°C孵育1h，再与生物素标记的二抗及链菌素亲生物蛋白-过氧化物酶复合物反应，常规DAB显色。阴性对照是用正常兔血清代替一抗进行免疫细胞化学染色。
2 结果
2.1 ATRA和AE对HL-60细胞的增殖抑制及诱导分化作用 图1显示，5×10－6mol／L ATRA或AE处理的HL-60细胞，G0／G1期细胞增多，处理4d后，约90％细胞受阻于G0／G1期，而对照组细胞则有50％处于S期或G2／M期；另外ATRA或AE处理4d细胞NBT还原能力显著增强（见表1），上述结果表明：ATRA和AE均能抑制HL-60细胞增殖，将细胞停滞于G0／G1期，并诱导其向粒细胞分化。
图1 ATRA或AE处理HL-60细胞G0／G1期细胞分布
Fig 1 The relative percentages of G0／G1 phase cells after exposure to ATRA or AE
表1ATRA和AE对HL-60细胞分化能力的影响
Tab 1Effects of ATRA and AE on differentiation of
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 血小板生成素转导鼠T淋巴细胞的增殖和分化
下一个医学论文： 井冈山市食品及公共场所从业人员乙肝表面抗原检测结果分析
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文