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sgp130 cDNA在痘苗病毒载体系统中的表达 |
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酶均购自Promega公司和Sigma公司。5-溴脱氧尿苷（BudR）和X-gal为Sigma产品。抗人gp130单克隆抗体（McAb）由美国Ben Chen教授惠赠。
1.2 sgp130重组痘苗病毒载体的构建 见图1。将经BamHI酶切的pSVL／sgp130用低熔点凝胶电泳法回收目的基因sgp130片段，用Klenow酶补平后，插入到已用SmaI酶切的pJSA 1175载体中，再用T4 DNA连接酶作平端连接，转化MC 1061受体菌，最后通过挑取菌落、抽提质粒和酶切鉴定筛选重组载体。
图1 重组痘苗病毒表达载体pJSA1175／sgp130的构建
Fig 1 Construction of recombinant expression vector pJSA1175／sgp130
1.3 重组痘苗病毒的构建和筛选 TK－143细胞传代至80％成片后，用0．1pfu／ml剂量的天坛株痘苗病毒感染细胞，37°C吸附2h后移出病毒，用无血清、无抗生素的DMEM洗细胞两次，加适量无血清培养基后，缓慢加入重组质粒DNA与脂质体的混合物（按LipofectinTM产品说明书配制）。37°C培养5h，补加等量含4％FCS的DMEM，37°C继续培养48h。然后将转染细胞连瓶反复冻融3次以破碎细胞，1 000r／min离心5min，除去沉淀，上清作为重组病毒液用维持液（含2％FCS的DMEM）稀释不同浓度后感染80％成片的TK－143细胞。此时培养液中含有25μg／ml BudR以抑制非重组的痘苗病毒，48h后在感染细胞上铺盖含有200μg／ml X-gal的1％营养琼脂，37°C培养24h，挑取单个蓝色病毒蚀斑，冻融3次后再接种TK－143细胞，连续纯化三代。
1.4 重组痘苗病毒的扩增和纯化 挑取已纯化至100％的单个蓝色病毒蚀斑，冻融3次后接种到80％成片的TK－143细胞；37°C吸附2h，补2％DMEM后置37°C 48h，吹打细胞至离心管中；冻融3次，冰浴超声粉碎细胞；800r／min低速离心5min，除去大的细胞碎片；上清再12 000r／min离心20min，沉淀即为重组病毒（Vsgp130）。取沉淀再感染细胞，如此反复扩增纯化6次，使病毒滴度达108pfu／ml。重组病毒用无菌PBS洗2次，溶于无菌PBS中，分装，于－70°C保存准备免疫动物用。
1.5 Western Blotting 收集感染重组病毒（V-sgp130）及野生型痘苗病毒（VTT）48h的TK－143细胞，12 000r／min离心20min；取上清浓缩10倍后，各取400μl加100μl样品处理液，煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳（100V，1．5h）；然后用电转印仪（Bio-Rad）转印至硝酸纤维素膜（0．45μm，Schleicher ＆ Schue 11产品），转印条件40V，4h，取出转印膜后浸泡于5％脱脂奶粉，37°C封闭1h；洗涤3次后依次浸泡于标准大鼠抗人gp130 McAb和HRP-兔抗大鼠IgG，室温下各反应1h；洗后加入DAB-H2O2显色。
1.6 免疫斑点结合试验（IDA） 取感染VTT和重组病毒48h的细胞上清，用PBS倍比稀释（原液1∶2，1∶4，1∶8，1∶16）后各取200μl用点样器点于硝酸纤维素膜上；抽干液体后置15％酪蛋白中37°C封闭1h；洗涤后依次浸泡于标准抗gp130 McAb、兔抗大鼠IgG-HRP中，最后用DAB-H2O2显色。
2 结果
2.1 表达载体的构建和鉴定 酶切电泳图谱（见图2）显示：构建的载体经EcoRI酶切可得到一个约2．4kb的片段，为正向插入的重组子，其中含2．0kb sgp130及400bp的痘苗病毒启动子序列；经XhoI及PstI双酶切，可得到一个约520bp的片段。PstI为sgp130基因中的一个酶切位点，距离SmaI位点约124bp。上述结果证实已成功构建了表达载体pJSA 1175／sgp130。
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