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急性肺损伤大鼠多核白细胞与肺组织 受体变化的相关性研究 |
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及代谢的调控。受体数目或功能的异常变化必将影响细胞自身及组织器官的功能，严重时就可引发或加重某些疾病过程［1］。作者既往研究证实［2］，内毒素(endotoxin,ET)性急性肺损伤(acute lung injury, ALI)时肺组织β-AR数目减少，功能下调。但临床上由于取材的限制，上述变化几乎无法检测，为了便于临床观察ALI时肺组织β-AR的变化，寻找其变化易于监测的相关指标便显得十分必要。本研究旨在通过静脉注射内毒素复制大鼠ALI模型，检测外周血多形核白细胞(polymorphonuclear leucocyte,PMN)和肺组织β-AR变化及其相关性。
材 料 和 方 法
一、模型复制及实验分组
(一)模型复制 将大鼠装入自制的鼠笼内先用75%酒精洗鼠尾，再涂适量二甲苯，待尾静脉充盈可辨，即从尾静脉注入ET 5mg/kg，然后将鼠放入鼠笼内自由活动。
(二)实验分组 51只健康成年雄性Wistar大鼠随机分为4组：(1)ET 1 h组(12只)；(2)ET 4 h组(12只)；(3)ET 6 h组(12只)；(4)正常对照组(15只)，于尾静脉注射等量生理盐水替代ET。
所有动物均于设定的时点经1%戊巴比妥钠40 mg/kg ip麻醉后，行颈动脉插管放血活杀。
二、肺组织β受体的放射性配基结合分析
动物活杀后立即开胸取出肺脏，按文献［3］制备肺组织细胞膜，用考马斯亮蓝法测定膜蛋白量，调配蛋白浓度为2 mg/mL。以［３H］-双氢烯丙洛尔(［３H］-dihydroalprenolol, ［３H］-DHA,比活性444×1010 Bq/mmol/L美国DU PONT公司)为标记配基，非特异结合管加心得舒(美国Sigma公司)，依文献［3］行结合试验，绘饱和曲线，据Scatchard作图求受体Bmax和平衡解离常数Kd。
三、外周血多核白细胞β受体的放射性配基结合分析
取鼠动脉血4～5 mL肝素抗凝，按文献［4］用percoll密度梯度离心法分离PMN，台盼兰查PMN活力，HE染色查PMN纯度，将PMN悬液调至2×10６细胞/mL，立即用于结合实验。β受体测定据Galant法［5］略加改进：反应总体积为180 μL，含PMN悬液50 μL， 加［３H］-DHA 50 μL(终浓度为0.1-10 nmol/L);总结合管加Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 10 mmol/L MgCl２, 1 mmol/L抗坏血酸，0.3 mmol/L儿茶酚，0.1 mmol/L酚妥拉明)80 μL；非特异结合管尚含有终浓度为10-6mol/L的心得安(美国Sigma公司)。各管置37℃反应15 min后，迅速加入5 mL冰冷的Tris-HCl缓冲液终止反应，然后经玻璃纤维滤膜行负压抽滤，将膜烤干后置于5 mL甲苯闪烁液(含0.4% PPO， 0.01% POPOP)中测其放射性(counts.min-1)，特异结合为总结合与非特异结合之差。绘饱和曲线及Scatcard图，求Bmax及Kd值。
四、肺体指数(lung body index, LBI)
五、形态学观察
首先观察肺脏大体病变，然后行HE染色光镜下观察。
六、数据处理
数据以±s表示，所有数据均行方差分析和t检验，用直线相关分析判断两参数之间的相关性。
结 果
一、肺组织β-AR的变化
静注ET后1、4、6 h，大鼠肺组织β-AR的Bmax均显著低于对照组(P＞0.01)，各ET组间差异不明显(P＞0.05)，平衡解离常数Kd值各组间均无显著差异(P＞0.05)(见表1)。正常肺组织β-AR饱和曲线和Scatchard图见图1。
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