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营养不良新生大鼠胰岛素与胰高血糖素及IGF |
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成年期胰岛素抵抗，甚至疾病的发生。
胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)是一类重要的、调节机体生长发育的生长刺激因子，分为IGF-Ⅰ和Ⅱ两种。目前认为，IGF-Ⅰ主要参与胎儿出生后机体发育，而IGF-Ⅱ的作用则更多地体现在调节胎儿期细胞的分化增殖［2］。研究表明，营养状态与IGF有着密切的联系［3］。
我们限制妊娠晚期雌性大鼠摄食量（低于正常50%），制备营养不良新生大鼠模型，观察①营养不良新生大鼠胰腺胰岛素、胰高血糖素基因表达的变化；②营养不良新生大鼠胰腺和肝脏IGF-Ⅱ基因表达水平。
材料与方法
1.材料：异硫氰酸胍、巯基乙醇、十二烷基磺酸钠、琼脂糖等(Sigma公司产品)。大鼠胰岛素cDNA、IGF-ⅡcDNA、胰高血糖素cDNA和18S rRNA寡核苷酸由美国Dr.Ullrich和法国Dr.Bouc等馈赠。
2.方法：
(1)营养不良新生大鼠动物模型建立：雌性Wistar大鼠，（250±10）g，随机分为对照组和试验组。单个饲养，自由摄食饮水，光照与黑暗12小时∶12小时。测定日摄食量（约50 g/d）。将上述雌鼠与雄鼠交配。次日晨取出雄鼠。以发现阴栓为交配成功，从妊娠期第14天开始，将试验组雌鼠每日饲料减少50%，直至分娩（第21天）。与此同时，对照组雌鼠自由进食。新生大鼠出生后立即称重并处死，快速获取胰和部分肝组织并立即置液氮中（防止RNA被分解），标本保存于-80℃备用。营养不良新生大鼠体重（5.58±0.15）g, 而正常对照新生大鼠为（6.87±0.51）g。
(2)总RNA提取与Northern印迹：采用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法［4］。由于新生大鼠胰腺非常小，将2只动物胰腺组织混合后抽提RNA。所得RNA标本，经琼脂糖电泳证实其完整性。用吸光度26O nm/28O nm比色定量及鉴定纯度。各取40 μg总RNA点样于1%琼脂糖凝胶中行甲醛变性电泳，利用毛细管转移至尼龙膜，小剂量紫外线照射固定核酸分子，干燥保存待杂交。
(3)探针标记与杂交：采用随机引物试剂盒标记cDNA探针(Amersham公司）。用Sephadex-G50柱纯化探针。杂交缓冲液为0.2 mol/L磷酸缓冲液，内含7%十二烷基硫酸钠，1%牛血清白蛋白和1 nmol/L EDTA。于65℃杂交16～24小时。洗膜后，采用放射性自动成像仪(Instant Imager,USA)测定杂交信号强度（单位1/min)，随后进行放射性自显影，曝光3～5天。尼龙膜经去杂交处理后可再次杂交。
(4)结果表示和统计分析：mRNA含量以各mRNA杂交信号强度(1/min)占相应18S rRNA杂交信号强度(1/min)的百分比（%）表示，以便更好地避免误差［5］。数据表示为±s。统计学分析采用t检验。
结果
1．对新生大鼠胰腺RNA进行Northern印迹分析，显示胰岛素mRNA和胰高血糖素mRNA均为单一转录片段，而IGF-ⅡmRNA表达，以3.7 kb和1.1 kb二种形式存在。经18S rRNA纠正后，各mRNA变化如表1所示。可见,营养不良新生大鼠胰腺组织胰岛素mRNA含量明显低于正常对照组（P<0.05），下降幅度为25.3%；营养不良新生大鼠胰腺组织胰高血糖素mRNA亦低于正常对照组，但统计学处理，差异无显著性（P>0.05）；营养不良组与对照组比较，IGF-ⅡmRNA丰度(3.7 kb和1.1 kb) 差异无显著性(P>0.05)。
表1 新生大鼠胰腺mRNA变化(n=9)
组别 胰岛素 胰高血糖素 IGF-Ⅱ
对照组 76.8±17.9
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