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不同饲料构成对大鼠肥胖基因表达产物 瘦素的影响 |
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作用，目前还不清楚。因此,本课题研究了不同饲料构成及不同能量摄入水平对大鼠ob基因表达产物——瘦素生物合成的影响，同时检测了血清中胰岛素、生长激素水平，以便探讨它们三者之间存在的相互关系。现将研究结果报告如下。
材料与方法
1．主要材料与仪器：①瘦素检测试剂：瘦素抗体（兔抗鼠）由美国康奈尔大学刘瑞海博士馈赠（Affinity公司产品）、二抗为羊抗兔多克隆抗体（HRP标记， 博士德公司产品），蛋白质发光检测试剂盒购自德国宝灵曼公司(Boehringer Mannheim)。二硫苏糖醇（DTT）、叠氮钠、丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、SDS均为Serva公司产品，TEMED为Kochlight公司产品。分子量蛋白质标准为Sigma公司产品。主要仪器有垂直式电泳槽、转移电泳槽、核酸-蛋白分析仪（Beckman, DU-640）。②胰岛素检测试剂：胰岛素放射免疫分析测定盒，购于北京北方生物技术研究所。③生长激素检测试剂：生长激素放射免疫分析测定盒， 购于北京北方生物技术研究所。④实验动物：Wistar大鼠（雄性）体重为100～130 g，共60只；雌性体重为80～110 g，共60只， 购于长春生物制品研究所。实验动物整个实验期间均在二级动物（清洁级）实验室饲养。
2．动物实验方法：将大鼠随机分成6组，每组20只，雌雄各半，分别喂饲基础饲料（A组，参照AOAC配方）、高蛋白质饲料(B组)、高脂肪饲料(C组)、高碳水化合物饲料(D组)、高能量饲料1(E组)、高能量饲料2(F组)。其中要求A～D 组饲料所含能量相同（均为1 546.32 kJ），E、F组饲料所含能量分别是基础中料组能量的1.2和1.4倍（即分别为1 855.58和2 164.80 kJ）。各组饲料配方及所含能量构成比分别见表1和表2。每2只大鼠饲养于1笼中，人为控制加食量，使每只大鼠平均摄入量相同（雌雄分别对待），以便控制能量摄入。饲养30天后，断头取血，制备血清以备检测胰岛素和生长激素用；制备血浆以备检测瘦素用。血清和血浆均贮存于-85℃超低温冰箱中。
表1 各实验组饲料配方(g/100 g饲料)
组别 酪蛋白 豆油 淀粉 混合无机盐 混合维生素 纤维素 总能量(kJ)
基础饲料组 10.00 8.22 63.90 3.50 1.00 13.38 1 546.32
高蛋白饲料组 30.00 8.22 43.90 3.50 1.00 13.38 1 546.32
高脂肪饲料组 10.00 16.44 45.41 3.50 1.00 23.66 1 546.32
高碳水化合物组 10.00 4.00 73.40 3.50 1.00 8.10 1 546.32
高能量1饲料组 10.00 23.49 48.00 3.50 1.00 11.36 1 855.58
高能量2饲料组 10.00 35.00 49.35 3.50 1.00 8.00 2 164.80
表2 各实验组饲料三大生热营养素提供能量百分比(%)
组别 蛋白质 脂肪 碳水化合物
基础饲料组 10.82
20.02
69.16
高蛋白饲料组 32.47 20.02 47.51
高脂肪饲料组 10.82 40.04 49.14
高碳水化合物组 10.82 9.74 79.44
高能量1饲料组 9.03 47.68 43.29
高能量2饲料组 7.62 60.00 32.38
3．瘦素检测：采用Western blot方法。取0.5 ml血浆，加入琼脂糖凝胶4B 后离心，再加含抗瘦素抗体的琼脂糖凝胶，进行免疫沉淀蛋白质。100℃加热3分钟， 使样品中蛋白质变性，离心、取上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电泳结束后，将凝胶固定，进行考马斯亮蓝染色。将凝胶上的蛋白用电转移法转印到硝酸纤维素膜上，先用一抗（即抗瘦素抗体）进行抗原抗体反应，然后用二抗进行抗原抗体反应，最后用蛋白质发光检测试剂盒（针对HPR）检测，X光片下曝光，用照相机拍照记录结果，同时用CS-960双波长飞点扫描仪对X光胶片上的曝光班点进行密度扫描，以便对瘦素水平进行定量分析。瘦素水平越高，密度扫描峰面积值（DM）越大。
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