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锌促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖及分化 |
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tiation Cell separation
近年的研究表明锌与骨代谢的关系非常密切［1］。锌可以促进动物骨发育以及骨钙化，促进体外培养MC3T3-E1成骨细胞蛋白质及DNA的合成［2］；补锌可以促进骨折或骨创伤的愈合。流行病学调查资料表明，对生长发育不良的婴幼儿补充锌，可以明显改善其身高的发育［3］。我们研究锌对体外培养大鼠成骨细胞增殖及分化的影响，为探讨锌在骨细胞生命活动中的作用和充分发挥锌的营养功能提供实验依据。
材料与方法
1.生化试剂:DMEM培养基(Gibco BRL)；小牛血清(华西生化制品厂)；胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、ZnSO4.7H2O为Sigma产品。3H-胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR),3H-脯氨酸及骨钙蛋白放免测定试剂盒由上海原子能研究所提供。
2.方法
（1）大鼠成骨细胞的分离及体外培养：参照Hiroko等［4］的方法进行大鼠颅骨成骨细胞的分离培养。将妊娠第19～21天的SD雌性大鼠用乙醚麻醉后，在无菌条件下迅速剖腹，从子宫中取出胎鼠。分离出胎鼠颅骨，仔细剥除骨膜和结缔组织。用Hank液清洗3次后，将其剪碎，加入含0.25%胰酶和0.1%胶原酶的消化液。37℃恒温振摇消化5分钟，收集细胞悬液，弃去。重新加入消化液消化60分钟，收集细胞悬液，并经100 μm孔径的金属网过滤。细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养，培养基为含10%小牛血清的DMEM。原代培养细胞融合后进行传代培养。一般取4～8代的细胞进行实验。
（2）实验分组：对照组培养基为基础培养基；实验组为10 μmol/L、25 μmol/L及50 μmol/L Zn2+3个剂量组，培养基Zn2+浓度分别为10、25及50 μmol/L。
3．测定指标及方法：
（1）DNA合成：采用3H-TdR参入法。取对数生长期细胞1×104接种于96孔板中。各实验组设立三复孔。培养36小时后，弃掉旧培养液，换上各组相应的培养基，同时各孔加入3.7×104Bq 3H-TdR。分别于6、12、24和48小时后弃去上清，加入0.25%胰蛋白酶消化分离细胞，用多头细胞收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，于液闪计数仪中计数测定。
(2)细胞周期测定：采用流式细胞仪进行检测。收集各组待测细胞用PBS洗涤两次后，迅速注入预冷的75%乙醇中，振荡混匀，4℃过夜。再用PBS洗涤细胞以除去乙醇。用溴化乙啶在暗处对细胞染色，30分钟后上机检测。
(3)胶原蛋白合成：将2×104细胞接种于24孔板中，培养24小时后，弃掉旧培养液，换上各组相应的培养基，继续培养2天。弃掉旧培养液，换上150 μl各组相应的培养基，同时加入3.7×105 Bq 3H-脯氨酸。24小时后取出上清液于玻璃试管中；用0.9% NaCl调至200 μl。加入5 mol/L乙酸25 μl、1 mg/ml胃蛋白酶25 μl、10 mg/ml脯氨酸10 μl，4℃保温2小时，用细胞自动收集仪将试管内上清及沉淀一起收集到用0.6 mol/L高氯酸预先湿润的玻璃纤维膜。0.6 mol/L高氯酸2 ml抽洗1次，最后用无水乙醇2 ml抽洗1次。将玻璃纤维膜晾干后，置于闪烁瓶中。加入10 ml闪烁液，于液闪仪中计数测定。
（4）骨钙素合成：将2×104细胞接种于24孔板中，培养基为各组相应的培养基。培养至第12天后，弃掉旧培养液，换上各组相应的培养基1 ml，继续培养3天。取上清液按照试剂盒程序进行骨钙素的放免测定。
（5）碱性磷酸酶(AKP)活性测定；将2×104细胞接种于24孔培养板中，培养24小时后，弃掉旧培养液，换上各组相应的培养基，继续培养3天后，将搜集细胞。用PBS洗涤2次后，加入0.1% Tritor X-100，置于4℃过夜。用吸管反复吹打细胞，使其完全裂解。取细胞裂解液按酶动力法进行AKP活性测定。AKP活性以每毫克细胞蛋白质每分钟产生对硝基苯酚的毫摩尔数（mmol.min-1.mg-1）表示。
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