|
M16添加牛磺酸和EDTA支持昆明白小鼠体外受精并发育至囊胚 |
| |
观察牛磺酸和EDTA能否支持昆明白小鼠的体外受精和植入前胚胎发育的全过程。
1 材料和方法
1.1 培养液及添加成分
所用培养液为：A: 改变的 M2,即在M2［4］ （Sigma 公司出品)中添加25mmol/L牛磺酸和100μmol/L的EDTA，用M2＋ET表示。B: 改进的M16, 即在M16（Sigma 公司出品)中添加25mmol/L牛磺酸和100μmol/L的EDTA，用M16＋ET表示［6］,用于体外受精和胚胎培养。C：在M16＋ET中再加入BSA使其最终浓度提高到14mg/ml， 该培养液仅用于体外受精。D：100倍牛磺酸和EDTA储备液，浓度分别为31.3mg/ml和3.72mg/ml，使用前加入M16中。以上培养液用三蒸水配制,经0.22μm滤膜过滤后保存在4℃冰箱。
1.2 实验动物及处理方法
供试鼠为雌雄昆明白小鼠(KM×KM)。饲养条件为人工控温22～26℃,14L:10D光照,自由饮水取食。取6～10周龄昆明白雌鼠经皮下注射7．5～10 IU的PMSG,间隔48h后腹腔注射同样剂量的hCG,注射hCG后15～17h断颈处死,分离取出输卵管部分置于清洁的卫生纸上除去血液,然后置于含300IU/ml透明质酸酶的M2＋ET中，撕开膨大部,使卵丘团流出,处理约5min,用100μl 的移液器吹打并经胚胎吸管［7］移入3次各0．5ml的M2＋ET洗后加入50μl的培养滴中，每滴培养液加入5～10个卵母细胞，然后等待加入获能的精子进行体外受精。
精子的获能：取雄性成年小鼠断颈处死后打开腹腔，取出睾丸。分离附睾尾部并剪开，置于预温的200μlM16＋ET 中，于37．5℃,5％的CO2培养箱中培养约30min，使精子游出，然后挑出附睾组织块并继续获能培养约1h，观察精子活力。用移液器取20～50μl获能的精子悬液，加入到含卵母细胞的培养滴中进行受精培养。受精时精子的浓度为5～10×105/ml。 6～8h后检查受精情况。取出有2个原核和极体的受精卵，经M2＋ET洗3次后尽量除去附着的精子，然后移入M16＋ET培养液滴（20μl）中培养120h。胚胎培养用直径35mm培养皿,每20μl覆盖石蜡油的微滴中放入4～10枚胚胎。每24h取出观察纪录一次发育情况。实验进行4次。
表1 M16＋ET对昆明种小鼠1－细胞体外培养的影响
Table 1 Effects of M16＋ET on the development of mouse
1－cell embryos in vitro
培养的受精卵数 发育至不同阶段的受精卵数(%)
2-细胞
2-cell 4-细胞
4-cell 8-细胞
8-cell 桑椹胚
morula 囊胚
blasto
34 34(100) 27(79) 24(71) 16(47) 16(47)
2 结果与分析
在M16＋ET和含高浓度BSA（14mg/ml）的 M16＋ET两组受精液中的受精率没有差异。受精卵各阶段的发育情况见表1。我们以往曾用M16进行过昆明白小鼠的IVF获得成功，并且受精率可达80％左右，所用卵母细胞未去卵丘细胞。但采用不经改进的M16不能克服昆明白小鼠胚胎发育的2－细胞阻滞现象。在45个受精卵中，有42（95％）可发育至2－细胞阶段，但无一例可到达4－细胞阶段（未发表资料）。
牛磺酸及亚牛磺酸对体外培养的仓鼠、小鼠和兔等胚胎发育均有促进作用，说明牛磺酸作用的普遍性,而且小鼠的输卵管液中就存在牛磺酸［8］。Spindle认为［9］,牛磺酸可能具有三方面的作用,其一为通过减弱有毒物质或通过渗透调节保护细胞膜;其二是抗诱变的效应;其三是可以和胰岛素受体结合起胰岛素样作用。本实验中，我们采用的牛磺酸浓度为25mmol。这是根据Li等(1993)在兔胚胎培养中发现的最佳浓度［10］。本实验的受精率范围在10％～22％之间，平均受精率为19％。受精率不高的原因可能是：（1）与精子活力不高有关；（2）所用卵为去卵丘细胞的卵。这是用同一种培养液完成昆明白小鼠的体外受精和发育至囊胚的首次报道。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 昆明山海棠诱导人白血病细胞HPRT基因突变的研究
下一个医学论文： 动物模型BLUP法评定内蒙古白绒山羊的遗传趋势
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文