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血清学标志阴性的非甲 戊型肝炎的病原学研究 |
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如下：
材料与方法
1.血清:87例血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎患者血清为中国医科大学附属第二医院、广西自治区卫生防疫站、北京佑安医院和河南省医学科学院肝病研究所提供。该87例非甲～戊型肝炎均为抗-HAV IgM, HBsAg, 抗-HBc IgM, 抗-HCV,抗-HEV阴性，所有血清均置-20℃冻存备检。
2.HBV DNA和HCV RNA的检测：均用华美生物工程公司的PCR试剂盒严格按照说明书进行操作并判断结果。
3.HEV RNA的检测：HEV RNA的提取、反转录以及基因扩增的方法及程序均与HGV RNA相同。HEV ORF2和 HEV ORF1的PCR引物为简并引物，由英国皇家免费医院医学院提供。
ORF1外引物：5'-CTGGCATYACTACTGCYATTGAGC-3'；5'-CCATCRARRCAGTAAGTGCGGTC-3'。
ORF1内引物：5'-CTGCCYTKGCGAATGCTGTGG-3'；5'-GGCAGWRTACCARCGCTGAACATC-3'。
ORF2外引物：5'-GACAGAATTRATTTCGTCGGCTGG-3'；5'-CTTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATC-3'。
ORF2内引物：5'-GTYGTCTCRGCCAATGGCGAGC-3'；5'-GTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTG-3'。
(注：Y为C或T；R为A或G；K为G或T；W为A或C)
AMV逆转录酶和Taq聚合酶均为Promega公司产品。
4.HGV RNA的检测：方法见参考文献〔2～4〕。
5.HCV、HEV和HGV PCR阳性产物的克隆测序：见参考文献〔4，5〕。
结 果
1.HBV DNA检测：对87份非甲～戊型肝病患者的血清进行HBV DNA检测，结果均为阴性。
2.HCV RNA检测和1份阳性产物的克隆测序：对87份非甲～戊型肝病患者的血清进行HCV RNA的检测，其中9份(10.3%)为HCV RNA阳性。但用Abbott抗-HCV酶联免疫试剂（EIA）对该9份HCV RNA阳性血清再次检测抗-HCV,结果为阴性。对其中1例PCR阳性产物（HN1）进行纯化,并克隆到pGEM4 T easy 质粒中进行测序，发现该株HCV与1b亚型的核苷酸序列的同源性为99.1%,说明该株病毒为典型的中国株（见图1）。
图1 从1名血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎病人血清中分离的 HCV 5'非编码区的核苷酸序列〔6〕
Fig 1. Nucleic acid sequence of HCV 5'-noncoding region isolated from the serum of a patient with serologically negative non A-E hepatitis
3.HEV RNA检测和阳性产物的克隆测序
(1) ORF1和ORF2 PCR引物检测结果：用ORF2引物检测64例非甲～戊型肝病患者的血清，其中有14例为HEV RNA阳性；从该64例非甲～戊型肝病患者的血清中随机抽取28例，用ORF1引物进行RT-PCR检测，结果有6例为RNA阳性；而在该28例中有13例为ORF2引物检测阳性。由此可见，ORF2的检出率明显高于ORF1的引物（见表1），但由于ORF2引物高度简并，带型较模糊，所有可疑阳性均需测序证实。
表1 ORF1和ORF2引物检测结果
Table 1.Comparison of PCR results with ORF1 and ORF2
Cases HEV ORF1 HEV ORF2
5 + +
1 + -
8 - +
14 - -
(2)阳性产物的克隆测序：对ORF1引物所测的PCR阳性或可疑阳性产物进行纯化，克隆到pCRIIT载体上，并进行测序。用该引物所得到的6条PCR产物序列中，有5条与典型的中国株基因序列的同源型超过95％，只有1株属于变异株；对ORF2引物所测的10例PCR阳性产物按与ORF2同样的方法进行测序，所得到的10条PCR产物序列中，有6条为变异株，与典型的中国HEV株的基因序列同源性只有80％左右（见图2和图3）。
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