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细胞间旁分泌在牵张刺激心肌细胞肥大中的作用 |
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of pressure-overload heart hypertrophy.
［MeSH］ Physical stimulation; Fibroblasts; Endothelium,vascular; Cardiomyopathy, hypertrophic
近年来研究表明，心脏是一个重要的内分泌器官，如已经证实的心脏肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）、心内膜和心外膜的内分泌功能等。但是，它们基本上是在整体动物上研究的，对于心肌组织中各种细胞的功能单独离体研究较少。心肌组织中心肌细胞占总重量的90%以上，在数量上却仅占总细胞数的60%，成纤维细胞、微血管内皮细胞等占近40%［1］。因此，成纤维细胞、微血管内皮细胞的功能变化必然对心肌细胞的生长、代谢、收缩等功能起到重要的调控作用［2-5］。目前，对于成纤维细胞、微血管内皮细胞在受到超负荷力学机械刺激后的内分泌功能有何变化及其在超负荷心肌肥大机制中的作用均不清楚。本文应用体外细胞牵张刺激模型，探讨牵张刺激是否诱导心肌成纤维细胞、微血管内皮细胞内分泌活化及其在心肌细胞肥大反应中的意义。
材 料 和 方 法
一、 心肌细胞、成纤维细胞的培养
参照Simpson等［6］的方法进行差速贴壁分离培养心肌细胞、成纤维细胞。
二、心肌微血管内皮细胞的培养
参考Chen等［7］的方法培养心肌微血管内皮细胞，0.1%胰酶-0.02%EDTA消化传代。用Ⅷ因子免疫组织化学方法鉴定。
三、成纤维细胞、微血管内皮细胞牵张刺激实验
消化已融合的成纤维细胞、微血管内皮细胞制成细胞悬液后，计数，按1×106/mL分别接种于牵张培养盒(其制作方法见另文)内，24 h后换液1次，此后隔48 h换液1次。第4 d时换以无血清DMEM培养基培养24 h，再换以3 mL无血清DMEM，然后进行20%拉长持续牵张硅酮膜，分别继续培养24、48、72 h后，收集培养液作为条件培养液［成纤维细胞条件培养液记为CF（conditioned-medium of fibroblasts）,内皮细胞条件培养液记为CE（conditioned-medium of endothelial cells）］，分别用于放免检测及刺激心肌细胞肥大实验。
四、条件培养基刺激心肌细胞肥大的观察
原代培养第4d的心肌细胞换以无血清DMEM培养24 h后,再按条件培养基（均用牵张48 h点）原液（CF、CE），无血清DMEM 1:1稀释（CF 1∶1,CE 1∶1）分组分别加入培养盒，对照组加无血清DMEM，同时按3.7×1010 mBq/L培养基加入［3H］-Leu，分别继续培养24、48、72 h后，用液闪counts*min-1计数方法测定［3H］-Leu掺入率,以反映蛋白质合成功能。
五、Losartan 和BQ123对条件培养基刺激心肌细胞肥大反应的抑制作用
原代培养第4 d的心肌细胞换以无血清DMEM培养24 h后, 分别加入losartan（1 μmol/L）和BQ123（1 μmol/L），10 min后加入条件培养基原液（CF、CE）。对照组仅加无血清DMEM。同时按3.7×1010 mBq/L培养基加入［3H］-Leu，继续培养48 h后进行液闪测量。
六、牵张刺激后培养上清中血管紧张素II及内皮素含量的测定
取出牵张完成后的培养上清3 mL，分作两份，注入已用冰水预冷的试管内(含EDTA-Na2 30 μL和抑肽酶40 μL，测内皮素用或含0.3 mol*L-1 EDTA 50 μL，0.34 mol*L-1 8-羟基喹啉50 μL及0.32 mol*L-1 2-巯基乙醇25 μL，测血管紧张素II），迅速混匀，4℃，3000 r/min，离心10 min，取上清-70℃保存待测。内皮素测定方法按301医院提供的试剂盒操作说明进行。血管紧张素II测定前冷冻抽干，用0.2 mL 冷PBS溶解，按海军总医院提供的试剂盒及说明进行测定。
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