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轻度修饰低密度脂蛋白对血管内皮细胞粘附功能影响及其机理初探 |
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ICAM-1. P-selectin induction may be partly involved in the process.
［MeSH］ Endothelium; Cells; Lipoproteins, LDL; Adhesions
血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)活化是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)发病的始动环节，WBC特别是单核细胞(monocyte, MC)与活化VEC粘附并迁移集聚于内膜下，摄取氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)形成泡沫细胞是AS发病的早期病理表现。其中，MC与活化VEC粘附是最早的细胞行为。食饵性及遗传性高胆固醇血症兔模型脂肪条纹出现在动脉内膜前已有大量MC粘附［1］。哪些因素促进VEC与MC粘附是被关注的课题。研究表明，Ox-LDL尤其轻度修饰LDL(minimally modified LDL, MM-LDL)具有多种生物学活性，AS损伤处的Ox-LDL氧化程度远比脂质条纹中的Ox-LDL要小，且体外用铁氧化LDL形成的MM-LDL与血循环中的Ox-LDL极为相似［2］。MM-LDL是否在始动AS发生中亦起着作用?本研究目的在于探讨MM-LDL对VEC粘附功能的影响以及其机理，为阐明AS的早期发生机制及防治提供依据。
材 料 和 方 法
一、细胞培养
(一)人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein EC, HUVEC)采用改良Jaffe法［3］。通过显微镜形态
观察及抗Von Willebrand因子抗体免疫荧光标记鉴定，以1∶2传代培养。本实验所用细胞为第1、2代。
(二)U937细胞 U937细胞是人单核细胞系，由本所免疫室惠赠，用RPMI-1640培养液(美国GIBCO BRL公司)在37℃、5%CO2温箱内培养。实验前用台盼兰染色，活性＞95%。
二、MM-LDL的制备
LDL购自医科院基础所(利用密度梯度离心法分离)。用铁氧化方法［4］获得MM-LDL。用Lowry法测LDL蛋白质含量，TBA反应法测定MM-LDL氧化程度。本实验所用MM-LDL的MDA含量为2.46-3.86 μmol/g，未氧化前的LDL含量为0.78 μmol/g。
三、U937和HUVEC粘附实验
用直接计数法［5］。HUVEC培养在24孔培养板内待完全汇合后，按以下分组加入含有或不含有刺激剂的M199培养液作用4 h。对照组：M199培养液；MM-LDL刺激组：M199培养液内含终浓度为75 mg/L的MM-LDL，即M199+MM-LDL(终浓度为75 mg/L)；阳性对照组：M199+rTNFα(终浓度5.0 μg/L)。加入浓度为1×106/孔U937细胞温育30 min后去除未结合的U937细胞。于显微镜下计数未结合的U937细胞数。利用下列公式计算出粘附率。
四、ELISA法检测HUVEC表面粘附分子
HUVEC培养在96孔板内待完全汇合后加入含有或不含有刺激剂的M199培养液在37℃、5%CO2条件下孵育4 h或18 h。经FAB固定液固定，0.1%的牛骨明胶封闭后，加入抗细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1)(phamingen USA)，抗血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion-1,VCAM-1)(phamingen USA)或抗P-selectin(phamingen USA) mAb 50 μL温育60 min。加入辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG 50 μL，于37℃湿盒内温育60 min，经底物缓冲液避光显色30 min后终止反应，测定492 nm处的光吸收值(OD492)。
五、统计处理：
结果用平均值±标准差(±s)表示，组间差异显著性测验用t检验。
结 果
一、MM-LDL对HUVEC与U937粘附的影响
MM-LDL 75 mg/L与HUVEC温育4 h组U937的粘附率明显增加，为(30.39±5.23)%(n=7)，对照组为(4.50±1.01)%(n=7)，两组间差异显著(P＜0.01)。阳性对照组r上一页 [1] [2] [3] 下一页
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