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一肾一夹 高血压鼠血清及组织内哇巴因含量及其与血压相关性的研究 |
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钠泵抑制物(endogenous sodium pump inhibitor, ESPI)”是新近发现的主要由肾上腺皮质所分泌的一种类固醇激素，盐、血容量扩张及血管紧张素II(angiotensin II, AngII)等因素可刺激其分泌增加，具有重要的生理和病理生理意义。大量证据表明，EO升高可能是高血压的发病因素之一［1-6］，而高血压研究的一种重要的动物模型“一肾一夹(1k1c)”高血压大鼠血清及组织内EO含量的改变及这种改变在血压升高中的意义国内外未见报道。本研究采用高度灵敏与特异的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，测定“一肾一夹”高血压大鼠体内EO含量的改变，并对血清及组织内EO含量与大鼠血压进行相关性分析，旨在进一步揭示EO的分泌特点及其在该模型血压升高中的作用。
材 料 和 方 法
一、“一肾一夹”高血压大鼠模型的制备
选择180-210 g雄性SD大鼠(n=14)，参照文献［7］介绍的方法制备“一肾一夹”高血压模型：用内径为0.30 mm的U形银夹夹住左肾动脉，1周后切除对侧肾脏。8只正常SD大鼠为对照组。每周2次间接法尾动脉监测血压（MRB-IIIA型大鼠血压心率测定仪，上海高血压研究所监制）。术后4周处死动物采集血清及心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、垂体、下丘脑等脏器备测。
二、ELISA检测法测定大鼠血清及组织内EO含量
(一)样本的采集及处理［8］
1. 血清样品 处死动物前一夜禁食、禁水。收集血清，等体积的0.1%三氟乙酸酸化标本，室温混合3 h，3 000 g离心30 min，取上清液注入已做预处理的C18固相柱内，接负压装置使标本通过小柱，去离子水冲洗3次，25%乙腈洗脱结合的哇巴因，收集洗脱液，冷冻干燥后0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶解备测。
2. 大鼠组织样品 摘取大鼠相应组织，生理盐水冲洗血液并用滤纸吸干后加入约10倍体积的甲醇，2 mol/L抗坏血酸，匀浆，离心后收集上清液并冻干，然后溶于0.1%三氟乙酸，过C18固相柱，以下操作同血清的处理。
(二)ELISA检测法测定大鼠血清及组织内哇巴因含量 参照本实验室建立的方法测定EO含量［9］，具体步骤如下：①包被：以1 mg/L的“卵清蛋白-哇巴因”包被96微孔板，100 μL/孔，4℃过夜(18-24 h)，洗板。②封闭：加入含2%牛血清白蛋白(BSA)的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，200 μL/孔，37℃ 1 h，洗板。③加样：以双蒸水配制哇巴因标准，浓度为0.39, 0.78, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 μg/L。分别加入50 μL的标准液或待测血清至标准孔和标本孔中（每份标准品及待测样本均做双孔，取两孔平均吸光度为测定值），并于每孔中加入50 μL的兔抗哇巴因抗体(自制，1∶12万稀释)，振荡混匀后37 ℃温育2 h，洗板。④加入辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗（华美生物工程公司，效价1∶1000），100 μL/孔，振荡混匀后37℃温育30 min，洗板。⑤显色：立即于各孔中加入OPD底物溶液，100 μL/孔，室温反应30 min，2 mol/L硫酸50 μL终止反应。⑥比色：490 nm测定吸光度。绘制标准曲线，计算待测样本中EO含量。
三、统计处理
实验数据均以均数±标准差（±s）表示，应用MS Excel5.0统计软件采用配对资料的t检验及直线相关分析对数据进行处理。
结 果
一、实验过程中大鼠血压的动态变化
与术前比较，摘除肾脏后1周1k1c大鼠血压即升高［(17.4±1.8） kPa vs （13.9±1.6） kPa，P＜0.01］，术后4周血压明显升高［(22.0±2.3） kPa vs （13.9±1.6） kPa，P＜0.01］。而正常大鼠组血压变化不明显。
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