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氧化低密度脂蛋白内皮受体在氧化低密度脂蛋白致内皮细胞损伤中的作用 |
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y minor effect on t-PA activity . When HUVECs were incubated with ox-LDL as well as LOX1 inhibitor, polyinosinic acid, these changes of endothelial cellullar morphology, the increase of PAI-1 activity and LOX1 mRNA expression were attenuated. CONCLUSION: LOX1 mediated HUVECs injury by ox-LDL, suggested that the activating of LOX1 may play an important role in pathogenesis of vessel injurious diseases.
［MeSH］ Receptors, LDL; Endothelium; Cells; Alteplase; Inhibin
大量证据表明由氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）诱发的内皮细胞损伤是导致动脉粥样硬化、高血压等血管损伤性疾病的重要因素，但其详尽机制还不甚明了。近年研究发现不同组织细胞上存在多种ox-LDL受体，其中血凝素样ox-LDL内皮受体（lectin-like ox-LDL receptor,LOX1）是1997年Sawamura等新发现的存在于血管内皮细胞表面的ox-LDL特异受体，本工作在培养的人脐静脉内皮细胞上，观察LOX1在ox-LDL致内皮细胞损伤中的作用。
材 料 和 方 法
一、 材料
人脐静脉内皮细胞系（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）由北京市肿瘤研究所提供，组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA）和纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibitor,PAI）活性检测试剂盒购自上海荣盛公司，引物由Gibco公司合成，逆转录试剂盒、Taq酶、dNTP、RNA提取试剂盒购自Gibco公司。
二、 方法
(一) HUVECs系培养 用含10%小牛血清的1640培养基培养，细胞汇集成单层达80%，0.01%胰酶37℃消化5 min，以2×105/孔接种于24孔板，培养24 h后加药。
实验分组：（1）对照组； （2）ox-LDL 25 mg/L；（3）ox-LDL 50 mg/L；（4）ox-LDL 100 mg/L； （5）ox-LDL 50 mg/L+polyinosinic acid（PIA）。
（二）ox-LDL的制备 参照文献［2］取健康人新鲜空腹血浆，采用二步法超速离心，分离低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL），LDL定量采用考马斯亮兰法。LDL氧化修饰采用铜离子法。LDL氧化修饰程度通过测定硫代巴比妥酸反应物质值，ox-LDL产生的丙二醛是LDL的4.3倍。
(三) 内皮细胞形态观察 不同组内皮细胞在相差显微镜下观察细胞单层和形态改变。
（四） tPA、PAI活性测定 采用发色底物法，操作按试剂盒说明进行。
（五） RNA提取 一步法提取细胞总RNA，经电泳鉴定未被降解，SDU-68型紫外分光光度计对RNA初步定量,测定A260/A280＞1.8，调整RNA浓度为1 g/L。
（六） RT-PCR 采用Gibco公司的反转录试剂盒，用Superscript RT 1 μL，1 μL细胞总RNA在37℃孵育1 h反转录合成cDNA链，72℃ 15 min终止反应，取2 μL合成的cDNA，1 μL人LOX1上下游引物（sense primer 5'-TTACTCTCCATGGTGGTGCC-3'，antisense primer 5'-AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC-3'）和内参照上下游引物各1 μL，在Tag酶作用下进行PCR，PCR条件:94℃变性40 s,55 ℃退火1 min, 72℃延伸1 min,扩增产物用加了溴化乙锭的琼脂糖电泳进行显影，β-actin作为LOX1mRNA定量的内参对照同时被扩增。
（七）电泳鉴定 配加了溴化乙锭的1.5%琼上一页 [1] [2] [3] 下一页
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