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一组毛囊真皮乳头细胞的单克隆抗体 |
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中共5次，最后1次倍量加强免疫。定期测定免疫小鼠的血清效价。最后一次免疫后第3d，按单抗标准方法进行细胞融合。制备小鼠脾淋巴细胞悬液，同鼠Sp2/0杂交瘤细胞按4∶1比例在50%的PEG1450(JT Baker Chemical Co)1ml中混合，融合后的细胞被移入含有HAT培养液(DME，15%热失活FBS，10%NU血清，100μmol/L hypoxanthine,40nmol/L aminopterin,16μmol/L thymidine, 100μmol/L gentamicin)的96孔板中培养。
2.单克隆抗体的筛选和研究［2］
采用双重免疫细胞化学法筛选相应的单克隆抗体。第1次用96孔板中培养的Fb为对照，用免疫细胞化学法筛选出DP阳性的克隆；第2次用大鼠冰冻皮肤组织切片的免疫细胞化学法筛选出感兴趣的单克隆抗体。产生特异性的杂交瘤细胞按常规方法被限制性稀释法再克隆3～4次以获得稳定的克隆。
筛选出的单克隆抗体作了荧光染色和激光共聚焦扫描观察。
结果和讨论
关于DP的分离和培养，文献中有多种方法，但实践的结果均不理想。我们改良了DP的分离和原代培养法［1］，DP生长良好，4～7d汇合，传代后生长速度加快。对照的真皮Fb生长正常。
本实验中筛选的90%的以上的克隆均呈DP和Fb阳性，这也证实了同为间充质起源这两类细胞的共性。以下3种单克隆抗体具有毛囊细胞的类型特异性：
RT37：为DP阳性的单抗，镜下可见毛囊纵切面上整个DP均匀呈阳性染色，无极性分布。阳性反应物见于DP表面。RT37也同时显示毛囊中下部(从毛囊的皮脂腺下方起到毛球基部)的结缔组织鞘细胞，鞘外的真皮Fb也有阳性染色(图1)。
WE65：特异性地显示毛囊的毛母质细胞(matrix cell)，镜下可见紧邻DP上方的全部毛母质细胞均呈强阳性染色，染色均匀，位于细胞表面。同时，下1/2的外根鞘(ORS)的全部鞘细胞呈稍淡的阳性染色，但毛囊上1/2的鞘细胞无阳性反应(图2)。
H4：仅染毛囊的隆突(Bulge)区域，皮肤和毛囊的其他结构均未被染色。荧光染色高倍镜下可见毛囊上段的Bulge的所有ORS细胞表面均呈强阳性染色(图3及其插图)，提示H4所结合的是细胞表面抗原。光镜和激光共聚焦研究发现，大鼠的Bulge为ORS细胞在皮脂腺和立毛肌间的一团突起，包绕此段毛发，H4显示整个Bulge细胞的分布，上部Bulge细胞较少，下部较多，阳性染色在细胞表面，较强、均匀，胞质内未见阳性反应(图4)。小鼠毛囊H4染色同上。
毛囊是由6～8种不同类型的细胞组成成层的同心圆结构，在毛囊的周期的不同时期中，DP有明显的形态学、生物化学和位置的变化，被认为是毛发生长和毛囊周期的重要调控部件［3］。
关于毛囊DP的单克隆抗体研究很少，至今尚未有DP特异性的单抗。本研究的大鼠DP单抗显示表面抗原，不与细胞骨架成分反应，而且对体内和体外培养的同样细胞类型均有标记特异性。
RT37显示大鼠的DP，同时也显示毛囊的结缔组织鞘细胞和鞘外的真皮Fb。这提示DP和Fb由于其共同起源而具有相当多的分子水平的共性，这也是寻找DP特异性的标记物的难点所在。
WE65强染毛母质细胞，也显示毛囊中下部的ORS细胞，但邻近的DP、内外根鞘细胞和周围的结缔组织细胞以及皮肤中的其他细胞(内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、脂肪细胞、表皮KC等)均为阴性反应。WE65的意义在于新近的研究表明毛母质细胞可能是毛囊生长和分化的TA细胞，即短暂扩增细胞(transient amplifying cell)［3］。
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