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与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的形态学和生长增殖 |
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ne-terephthalate)作为联合培养的载体，才建立了更为简单实用的模型。国外联合培养的研究主要集中在平滑肌细胞，对联合培养的内皮细胞只有零星报道。国内内皮细胞和平滑肌细胞联合培养的工作目前只有我们的初步报道［2］。
材料和方法
1.内皮细胞和平滑肌细胞的原代培养及联合培养模型的建立
新生小牛胸主动脉5～10cm，去除外膜，用0.1%胶原酶和0.125%胰酶(Sigma公司)的混合液(1∶4)消化，收集消化液将细胞以5×104个/ml浓度种植于培养瓶中。将上述血管的中膜剪成1×1mm的小块，置于胰蛋白酶中消化，细胞悬液用含血清培养基稀释并种植于培养瓶中，2～3d换液1次。
传代至2～10代的平滑肌细胞经胰酶消化，调整细胞浓度到5×104个/ml，种植于PET膜(美国Falcon公司)的外面，12h后细胞贴壁完全，将膜翻转，在膜的内面以同样的浓度种植2～10代的内皮细胞，然后将PET膜插入配套的6孔培养板(美国Falcon公司)中，进行联合培养，观察到细胞贴壁时为长三角形或长梭形，即为模型建立成功。同时，以单独培养的内皮细胞和在平滑肌细胞的条件培养基中培养内皮细胞分别作为对照，见图1。
图1 内皮细胞的培养模式图
A：单独培养的内皮细胞；B：条件培养的内皮细胞；
C：联合培养的内皮细胞
Fig.1 culture model of Ecs
A,Ecs cultured alone; B,Ecs cultured in condition media;
C,Co-cultured Ecs.
2.内皮细胞形态学观察
每天在倒置相差显微镜下观察细胞的贴壁时间、生长状态和形态，并摄片记录。取标本各1组，苏木素、伊红染色，倒置显微镜下观察并摄片记录。3种培养条件下的内皮细胞，各取其2、4、6d的细胞标本，按常规透射电镜切片操作，观察并摄片记录。
3.内皮细胞计数
上述3种培养条件下的内皮细胞，每天各取3孔，经胰酶消化后，用细胞计数板计数，取其均值，所得数值绘制成曲线。
结果和讨论
1.内皮细胞和平滑肌细胞联合培养新模型的特点
本实验建立的内皮细胞和平滑肌细联合培养新模型的关键是以多孔PET膜作为内皮细胞和平滑肌细胞间基质层的替代物。PET膜不仅可作为支持载体，能在其两侧分别种植内皮细胞和平滑肌细胞，还具有生理基质的两个结构特点：(1)厚度40～80nm，利于内皮细胞和平滑肌细胞间形成连接；(2)窗孔样结构(孔径0.45μm)：一方面可溶性分泌因子可以相互交流，另一方面内皮细胞与平滑肌细胞胞质间的连接又能通过窗孔形成，同时还能限制细胞通过窗孔伸延到移植物的另一侧。虽然替代物只能部分模拟生理基质的特点，但它所具有的两个结构特征允许细胞间基本的信息联系顺利进行，因此为研究内皮细胞和平滑肌细胞的相互关系提供必要条件。同时，PET膜又是一种无机合成材料，自身不参与影响细胞的生活状态，它的应用使得联合培养模型更为简单、实用。我们认为，与以往的培养方式相比，内皮细胞和平滑肌细胞在膜两侧接触联合培养的新模型是目前体外研究这两种细胞间作用的最佳模型。
2.与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的形态结构特点
在体环境中，受血流切应力的影响，内皮细胞的形态将发生与其所受力学环境相适应的改变，主要表现为，随血流方向的极性排列，伸长的流线形外观，这种改变主要使细胞表面受力有梯度的变化，以增强其抗变形抗应变能力。本实验观察到，单独培养的内皮细胞，开始贴壁时细胞呈多边形，细胞微丝大多散在分布于胞质中，也有少量成束分布，排列无方向性。加入平滑肌细胞或平滑肌细胞的条件培养基进行培养，24h后内皮细胞呈明显伸长的改变，单层、排列无极性，细胞边界清楚，细胞胞质中微丝大多数为束状与细胞长轴平行排列，见图2，3。这种形态特征与体内生理状态下的内皮细胞形态更为接近。与单独培养的内皮细胞相比，联合培养的内皮细胞内部结构的改变主要表现在微丝的形态和分布，单独培养内皮细胞的微丝多为散在分布无方向，联合培养的内皮细胞大多呈束状与细胞长轴平行分布。这与体内应力状态下内皮细胞中微丝的状态相似，应力环境会使细胞骨架系统发生变构和重排，以求能更好地适应力学环境。
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