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RNA DNA嵌合分子介导的高效基因修复 |
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ion directed by chimeric RNA/DNA oligonucleotides）技术［23］ 克服了上述缺点，将对人类疾病的基因治疗产生重要影响。
1 RNA/DNA嵌合分子介导的基因修复的机制
RNA/DNA嵌合分子介导的基因修复（targeted gene correction)，也可称为基因转变(targeted gene conversion），是指用含有RNA成分的寡核苷酸分子（一般长68nt）转染细胞，利用细胞内DNA错配修复机制，改变靶基因上的特定碱基的过程。1996年，托马斯杰弗逊大学癌症研究所的Kmiec小组在美国科学院院报上发表文章［23］，开创了RNA/DNA嵌合分子介导的基因修复的时代。早在1994年，Kmiec小组在研究RecA蛋白介导的DNA配对（DNA pairing）时发现，RNA能极大地提高DNA配对的效率［10］，而他们认为DNA配对的效率是同源重组的关键步骤。据此，他们设计了一种RNA/DNA嵌合在一起的寡核苷酸分子［23］（图1）。在要改变的碱基处设计5个DNA碱基（脱氧核糖核苷酸），两侧分别加上10个RNA碱基（核糖核苷酸），并对其中RNA碱基的2的－OH进行甲基化修饰，然后在3ˊ端加上5个GC保护碱基，再在两端各加上4个T碱基，然后回折成互补双链（全长68个碱基）。这一人工合成分子的二级结构呈A型螺旋（ADNA）［22］。在要改变的碱基两侧的24个碱基与靶位点的序列完全互补，只有要改变的那个碱基不同。
RNA/DNA嵌合分子两端形成的发卡结构可以防止嵌合分子被细胞内的核酸外切酶降解，防止解旋酶使嵌合分子不稳定，而且还可以防止形成首尾相接的多联体分子；RNA成分的存在将极大地提高同源配对的效率；对嵌合分子中的RNA碱基进行甲基化修饰，可以防止嵌合分子被RNase H降解。不形成共价闭环的目的是允许嵌合分子自由进行拓扑翻转，有利于同源配对［22］。
Kmiec［11］认为RNA/DNA嵌合分子介导的基因修复的可能机制是（图2）：(1)在脂质体的帮助下，嵌合分子穿过细胞膜与核膜，进入细胞核［23,24］；(2)Rec A样蛋白［7，10］参与的DNA配对，使嵌合分子与染色体上靶位点DNA形成双D环结构，RNA成分的存在大大提高了这一结构的稳定性，增加了它的半衰期，这正是提高同源重组效率的关键；(3)很可能是DNA错配修复机制介导碱基转变这一过程。在DNA错配修复相关酶的参与下，以RNA/DNA嵌合分子为模板，将靶位点不配对的碱基替换成与模板配对的碱基，而且这一转变是可遗传的，有表型效应。原核细胞和真核细胞中都存在有能力介导这种反应的细胞机制。
图1 RNA/DNA嵌合分子示意图(仿Kren等,见参考文献[12])
小写字母代表甲基化修饰的RNA碱基，大写字母代表DNA碱基，灰色方框代表的是要改变的错配碱基，斜体大写字母代表的是以要改变碱基为中心的5个DNA碱基
Fig.1 RNA /DNA chimeric oligonucleotides (After Kren et al ,see rdference [12]The 2'O-methl RNA residues are in lowercase type adn DNA residue s are in uppercase type .The target site is in solid box and the five DNA residues surrounding the target site are in italic type )
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