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SLE模型新西兰小鼠高IgG血症易感基因的定位 |
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titative trait locus,QTL)分析［4］，从而定位出高IgG血症的易感基因。
1 材料与方法
1.1 实验试剂 分别购自日本和光、利根株式会社，微卫 星遗传标记购于美国Research Genetics,Huntswille,AL。
1.2 实验动物 NZB、NZW、NZB/W F1 小鼠购于日本静冈实验动物中心，二级动物。回交小鼠以雌性NZB/W F1与雄性NZW小鼠回交，实验中使用的回交小鼠全部为雌性，共220只。
1.3 基因分型
1.3.1 提取DNA 取回交小鼠尾部组织，用苯酚及氯仿抽提基因组DNA，提 取的DNA以分光光度计(shimadzu UV-2100)测OD260 nm值，然后，将220只回交小鼠DNA调至 同一浓度8 μg/ml，-70℃保存备用。
1.3.2 微卫星遗传标记的选择 选用在NZB、NZW小鼠间具有多态 性的微卫星遗传标记，其数量的选择依染色体长度而定。两端的遗传标记距染色体两端距离＜10 cM( centiMorgan)，遗传标记之间距离＜20 cM，共计167个，覆盖小鼠19条染色体(见图1)。染色体总平均覆盖率为96.8%(见表1)，该覆盖率以每个遗传标记覆盖上下各10 cM为标准计算。
图1 实验中使用的多态性微卫星遗传标记
Fig.1 Polymorphic microsatellite markers used in experiment
表1 多态性微卫星遗传标记在染色体上的覆盖率
Tab.1 Cover rates of chromosome covered by the
polymorphic microsatellit e markers
Chr.No. Amounts of markers Cover rates of Chr.(%)
1 11 96.5
2 13 100.0
3 8 100.0
4 15 100.0
5 9 100.0
6 8 96.7
7 11 100.0
8 11 96.4
9 7 100.0
10 6 93.7
11 7 100.0
12 5 100.0
13 7 100.0
14 10 100.0
15 7 80.9
16 5 83.2
17 14 100.0
18 5 100.0
19 8 91.9
Total 167 96.8
1.3.3 PCR扩增微卫星DNA片段 用96孔反应板在PE9600型PCR仪中进行。总反应体积7.5 μl,包括基因组DNA 20 ng/ml，Taq酶0.5 unit。反应条件：94℃预变性3 min ，94℃ 30 s；58℃ 40 s；72℃ 1 min，45个循环，末次延伸72℃ 3 min。
1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及溴化乙锭染色 PCR产物加入5 μl含 二甲苯青及溴酚蓝5×TAE缓冲液，于18%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离后，溴化乙锭(2.5 mg /ml)染色10 min，紫外透射仪下观察、拍照。
1.3.5 基因分型 将PCR产物即扩增的微卫星DNA片段进行PAGE分离后，根 据分离片段大小决定回交小鼠的基因型，如在PAGE胶上为一条片段，则为W/W型，两条片 段为B/W(见图2)。
图2 回交小鼠的基因分型
Fig.2 Gene typing of backcross mice
1.4 血清总IgG水平的测定 采用ELISA法。样本为8个月龄NZB、NZW、NZ B/W F1 小鼠及回交小鼠血清。
1.5 统计学处理 采用QTL分析及t检验。
2 结果
2.1 NZB、NZW及NZB/W F1 小鼠间血清总IgG水平的比较 t检验结 果显示(见图3)：NZB小鼠血清总IgG水平明显高于NZW小鼠(P＜0.05)，NZB/W F1小鼠血清总Ig G水平明显高于其亲代NZB(P＜0.05)及NZW(P＜0.005)，提示导致高IgG水平的相关 基因主要与NZB小鼠有关，而NZW小鼠可能上一页 [1] [2] [3] 下一页
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