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反义bcl |
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调节作用均已被证实。反义bcl-2寡聚核苷酸可抑制正常骨髓干细胞和白血病细胞中bcl-2的表达，缩短细胞生存期；减少培养中细胞形成克隆的数目［1,2］。但是反义bcl-2抑制基因表达在鼻咽癌细胞尤其是活体水平的研究未见报道。bcl-2与bax是互相拮抗的蛋白，bcl-2能使细胞生存期延长和抵抗凋亡，bax促进细胞凋亡［3］。本研究设计将反义的bcl-2 DNA直接注入CNE2-baxα细胞株接种形成的肿瘤组织，研究bcl-2被封闭后肿瘤组织细胞的变化。
材料与方法
一、材料：
1. 细胞株CNE2-baxα，本研究室将凋亡基因baxα导入CNE2细胞获得［4］。
2. BALB/c裸鼠，4～6周龄，本校实验动物中心提供。
3. ASON片段：根据bcl-2 cDNA序列选择第264～285的22个核苷酸为靶序列，由上海细胞研究所合成，序列为5’GGTGCCCACCTGTGGTCCACCTG3’，溶于生理盐水，参照文献［2］，确定ASON浓度为45 μmol/L，即为反义bcl-2 DNA溶液。
二、方法：
1.接种肿瘤细胞：CNE2-baxα细胞培养至3×106个细胞，体积0.5 mL，注射入裸鼠颈背部皮下，1周后，取肿瘤组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小接种于16只裸鼠颈部双侧皮下。
2. 给药：接种1周后，量取肿瘤组织大小为5 mm×3 mm，并将45 μmol/L反义bcl-2 DNA 50 μL注入右侧肿瘤组织［5］。左侧注入生理盐水对照，隔周测量双侧肿瘤大小。用公式(1)/(2)LW2(L为肿瘤长径，W为肿瘤横径）计算肿瘤重量［6］。
抑瘤率=×100%
3. RT-PCR检测bcl-2封闭情况：注射反义bcl-2 DNA后1周取肿瘤组织，参照文献［4］，抽提总RNA，检测其中mRNA 水平bcl-2的表达。
4 电镜观察癌细胞凋亡：反义bcl-2 DNA注射1周后，取两侧肿瘤组织块，2.5%戊二醛预固定，固定，磷酸-蔗糖缓冲液漂洗过夜，1%锇酸固定，系列乙醇-丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅复染，HITACHI电镜观察。
结 果
一、RT-PCR检测肿瘤组织中bcl-2封闭的效果：
反义bcl-2 DNA处理1周后，抽提对照组与试验组肿瘤组织总RNA, RT-PCR测定。
图1显示，在对照组中的较明显的bcl-2 459bp条带，在试验组中未出现，说明肿瘤组织bcl-2的表达被反义片段封闭。
Fig 1 RT-PCR analysis of bcl-2 mRNA in tumor
1. DNA Marker; 2.RT-PCR of bcl-2 and β-actin in control group；3.RT-PCR results of bcl-2 in experimental group (negative)；4.RT-PCR of β-actin as control in experimental group
图1 RT-PCR扩增肿瘤组织bcl-2 mRNA 电泳分析
二、 反义bcl-2的抑瘤率：
反义bcl-2 DNA片段溶液注射入肿瘤组织后，分别于7、14 d量取双侧肿瘤大小，计算瘤重结果如表1。
表1 反义bcl-2的抑瘤作用
Tab 1 Antisense bcl-2 inhibits tumor growth (±s)
Group Time(d) Number of
sample Tumor
weight(mg) Tumor-inhibiting
rate(%)
Group A 7 16 418±55 —
Control 14 14 931±139 —
Group B 7 16 107±7 74.4
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