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分泌人源性单克隆抗体永生化淋巴细胞系的构建 |
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hich secrete human monoclonal antibodies, and provide a technological approach for producing human monoclonal antibody.
MeSH Lymphocytes; Antibodies, monoclonal;Transfection; Immunization; Ovarian neoplasms
人源性单克隆抗体(human monoclonal antibody, HMcAb)优于鼠源性单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)，但HMcAb制备的困难颇多，特别是人B淋巴细胞的抗原致敏和永生化。近年来采用体外免疫以致敏人B细胞，但其所需要条件还不很了解。EBV转化虽可使致敏B细胞永生化，但因其存在诸多缺陷而甚少单独采用。新近兴起的基因工程抗体技术，人们寄予期望［1］。
我们曾用DNA转染技术构建了两株永生化鼠淋巴细胞转染体，它们能不断产生抗宫颈癌McAb，并能在含血清和无血清培基中长期生长［2］。
本文报道，以低分子量卵巢癌细胞表面可溶性抗原体外免疫人脾细胞，用卵巢癌细胞DNA转染经体外免疫的人淋巴细胞；将所形成的转化细胞进行筛选和克隆，构建能产生抗卵巢癌HMcAb的永生化人转染体淋巴细胞系。
材料与方法
(一)培养液、细胞和细胞系：
1.基础培养液：RPMI 1640培养液(Gibco),每升含5 mg胰岛素，5 mg转铁蛋白，10 μg硒，2 μL 乙醇胺，0.3 g谷氨酰胺，0.11 g丙酮酸钠，10 mg庆大霉素。
2.人卵巢癌细胞系ao10/17：购自中国科学院细胞生物学研究所细胞库，生长于含10%(V/V)FCS的RPMI 1640培基中。
3.人卵巢癌细胞OV：来自江西省妇产医院经确诊的卵巢癌病人的腹水，离心后用PBS洗3次，备用或-70℃冻存。
4.人脾细胞：来自一附院外科脾破裂病人手术切除的标本。切碎、通过200目不锈钢网，Tris-NH4Cl处理5 min，制成悬浮细胞，备用或-70℃冻存。
(二)人卵巢癌细胞表面可溶性抗原的制备：按本室报道的LeGrue正丁醇提取法的改良法［3］，将ao 10/17和OV细胞分别用2.5%正丁醇处理5 min，然后离心10 min，收集上清；将上清离心(15 000×g)30 min，透析，制得人卵巢癌细胞表面可溶性抗原，ao CBE和OVCBE，将前者进行SDS-PAGE测定。
(三)人淋巴细胞体外免疫：
1.体外免疫培基制备：将基础培基加入IL-2(2.5×104 U/L)和IFN-γ(4×105U/L)。
2.体外抗原刺激：将制得的人脾细胞(3×109/L)悬浮于体外免疫培基中；加入ao CBE(6 mg/L)，24 h后加入FCS(终浓度为15%)；置于37℃，7% CO2孵育箱内培养15 d，其间每隔4 d加入20%体外免疫培基。获得的致敏人淋巴细胞供DNA转染用。
(四)卵巢癌细胞ao 10/17 DNA转染致敏淋巴细胞：按我们发表的Jonak等的方法的改良法［2］并参照Sambrook等的方法［4］制备DNA和DNA共沉淀物并将后者转染致敏淋巴细胞。
(五)淋巴细胞转染体产生的特异性抗体的检测：按间接ELISA［3］：用包被缓冲液稀释ao CBE至5 mg/L，酶标板每孔加入50 μL，4℃孵育过夜；加入50 μL转染体细胞培养上清液(以正常人脾细胞培养上清液为阴性对照)，37℃孵育2 h；最后加入底物(OPD)溶液50 μL，37℃孵育30 min。终止后，以酶标仪测定A490 值。
(六)转染体细胞克隆化：96孔培养板加入BALB/C小鼠脾细胞，将针对ao CBE的特异性IgG抗体阳性反应转染体细胞，按有限稀释法做单克隆细胞培养。
(七)转染体McAb的制备：将克隆3次的转染体细胞在含10%小牛血清培基中扩大培养，其培养上清液用硫酸铵沉淀。
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