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表达反义hREV3 基因片段的真核细胞表达质粒的构建 |
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为含有hREV3基因全编码序列(2.1kb［3］)的pBluescript SK、重组质粒］; pMAMneo amp-［本室提供［4］,从pMAMneo (Clontech公司)改建而得,在细菌中扩增具有卡那抗性,外源基因的表达需地塞米松诱导］;pBK-RSV(Stratagene公司)。限制性内切酶购自ToKaRa公司和Promega公司。
二、两种长度hREV3 cDNA目的片段的制备：
对pBS-hREV3进行双酶切和单酶切得到含有hREV3cDNA特异性保守序列的两种片段：357 bp短片段(hREV3 short fragment ,RS表示)和742 bp长片段(hREV3 long fragment,RL表示，另带有pBS载体上极小的一段序列)。电泳分离,透析袋法回收目的片段。
三、重组子构建：
1.持续表达载体pBK-RSV与两种长度目的片段(RS、RL)重组体构建：酶切pBK-RSV和pBS-hREV3，4 ℃，T4 DNA 连接酶连接过夜,转化感受态细菌DH5α，提取质粒。单酶切的片段有正、反方向插入, 酶切筛选出正向和反向重组质粒, 以:pB-RL(+)、pB-RL(-)表示(此处pB表示载体pBK-RSV ；+、-分别表示正、反方向) 。双酶切的片段只以一种方向插入,筛选得到一种反向重组质粒，以pB-RS(-)表示（图1）。
Fig 1 Construction of recombinan
B:BamHI； H:HindⅢ；S:Sall； pB:pBK-RSV；pM:pMAMneo amp-；+：ordinary orientation; -：reverse orientation;
RL:long fragment of hRev 3(742 bp); RS:short fragment of hRev 3(357 bp)
图1 构建重组体技术路线
2.诱导表达载体pMAMneo amp-与357bp hREV3 cDNA片段(RS)的重组体构建：酶切重组体pB-RS(-)和载体pMAMneo amp-(以pM表示)，4 ℃, T4 DNA连接酶连接过夜,转化感受态细菌DH5α,在含卡那霉素的LB培养基上选取单菌落,酶切筛选出正向和反向重组体，分别以：pM-RS(+)、pM-RS(-)表示 (图1)。
结 果
一、重组体构建及其正反取向的鉴定：
1.持续表达载体pBK-RSV与hREV3短片段(RS)构建的重组体pB-RS（-）(图2)：对选出的质粒（Lane 4），用BamH I+Hind III双酶切进行进一步确认，该质粒被切出2条片段：357bp、4434bp(Lane 7)，分别与同样双酶切自质粒pBS-hREV3及表达载体所得到的片段357bp（Lane 5）和4434bp（Lane 6）长度同，故确认该质粒为重组体，并为反向重组体,定名为:pB-RS(-)。
Fig 2 Electrophoretic analysis of recombinant pB-RS(-)
1. λDNA/Hind ⅢMarkers; 2. pBS-hREV3 digested with EcoRⅠ；3～4. pBK-RSV and pB-RS(-) digested with BamH I; 5～7. pBS-hREV 3、 pBK-RSV and pB-RS(-) digested with (Bam H Ⅰ+HindⅢ); 8. pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA Markers
图2 pB-RS(-)重组体鉴定
2.持续表达载体pBK-RSV与hREV3长片段(RL)构建的重组体pB-RL(+)、pB-RL(-) (图3)：选出的两个质粒, 经BamHI酶切均得到2条片段742bp和4452bp(Lane4～5),分别与pBS-hREV3和pBK-RSV自BamHI酶切所得片段742bp (Lane2)和4452bp(Lane3)相同,故可确定此两个质粒为重组体,暂定名为pB-RL-1和pB-RL-2。 用Hind III酶切鉴定方向，正向插入应有：375bp和4819bp 2条片段，而反向插入应有：403bp和4791bp 2条片段。经分析确认pB-RL-1（Lane7）上一页 [1] [2] [3] 下一页
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