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表达反义hREV3 基因片段的真核细胞表达质粒的构建 |
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徐方 余应年 胡文蔚
摘 要 目的:构建真核细胞表达重组体，为今后利用反义核酸阻断技术研究hREV3基因功能及其与细胞遗传不稳定性的关系提供物质材料。方法:用内切酶BamH I及BamH I+Hind Ⅲ分别对pBS-hREV3进行单酶切和双酶切,从而得到含hREV3 cDNA特异性保守序列的两种长度(742bp 和357bp)片段,分别将两者插入真核细胞表达载体:pBK-RSV(持续表达载体)和pMAMneo amp-(表达需经地塞米松诱导)。结果:经酶切图谱分析,筛选出含正向和反向插入片段真核细胞表达重组体5种。结论:为深入研究hREV3基因功能奠定基础。
主题词 遗传学；基因， REV；RNA，反义
Construction of eukaryotic expression plasmid expressing antisense fregment of hREV3
XU Fang， YU Ying-Nian， HU Wen-Wei
Dept. of Pathophysiology,Zhejiang University,Hangzhou(310031)
Abstract AIM: To construct the eukaryotic expression plasmid to study the role of hREV3 gene in genesis of genetic instability by means of antisense technology. METHODS: Two fragments with different length (742bp and 357bp) that constain the specific conserved region of hREV3 cDNA were obtained by digesting plasmid pBS-hREV3 with restriction enzymes BamH I and BamH I plus Hind III respectively .Two kinds of fragments were inserted into two kinds of eukaryotic expression vector : pBS-RSV(used for constant expression and pMAMneo amp-(used for inducible expression).The inserting orientation of recombinants were identified by digesting with restriction enzymes and electrophoresis analysis. RESULTS: Obtained five kinds of recombinant containing the insertions in sense and antisense orientation. CONCLUSION: These results provide an important basis to further study in genetic instability.
MeSH Genetics; Genes, REV; RNA, antisense
REV3基因是近年来在酵母研究中发现的,它与REV7共同编码合成DNA聚合酶ζ (Polζ),参与DNA损伤诱导的突变形成。REV3基因突变不仅能降低由于紫外线、离子辐射或烷化剂处理造成的DNA损伤诱导的突变形成,而且能使真菌自发突变率降低20%［1,2］。人Polζ的编码基因cDNA已从人的cDNA文库中克隆出,命名为hREV3（2.1kb),定位于染色体1p32～33,其mRNA>10kb,并证实它在一些肿瘤中表达增高［3］，提示其表达增高与肿瘤发生有关,可能对遗传不稳定的诱发起着重要作用。我们将利用反义RNA技术来特异性阻断真核细胞hREV3基因的表达,由于真核细胞基因表达调控复杂,在研究hREV3基因功能时,我们构建了诱导表达的和持续表达的反义重组质粒，构建中获得的正向插入的重组体将作对照用。
材料与方法
一、质粒与有关酶：
pBS-hREV3 ［加拿大Saskatchewan大学W.Xiao博士提供,pBS-hREV3[1] [2] [3] 下一页
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