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血小板活化因子在颈髓损伤后线粒体功能损伤中的作用 |
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tect mitochondrial function after trauma.
MeSH Wound and injuries; Mitochondrial; Platelet activating factor; Receptor
如何改善颈髓损伤后颈髓神经功能损害、降低瘫痪及死亡率是临床迫切需要解决的课题。线粒体是细胞功能活跃的亚细胞器，细胞生命活动所需能量90%以上由线粒体氧化磷酸化提供，线粒体功能改变直接影响神经细胞的功能。近年来，血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)在脑中风、脑水肿中的作用倍受关注［1］，至于PAF及其受体对颈髓损伤后颈髓线粒体功能的作用研究甚少。本实验采用超速离心法分离颈髓细胞粒体，观察了PAF及其受体拮抗剂BN52021对颈髓损伤后线粒体Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性及线粒体呼吸功能的影响，从亚细胞水平探讨PAF及其受体对脊髓损伤后继发性损害的作用机制。
材料与方法
(一)颈髓损伤模型复制及分组：健康成年雄性猫70只，体重2.5～3.5 kg,随机分成假手术组(对照组)、单纯脊髓损伤组(simply spinal cord injury, SSCI)、脊髓损伤(SCI)+人工脑脊液组(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)、SCI+PAF组、SCI+BN52021组。每组14只。各组动物均用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg ip)麻醉。咬除C6,7椎板，显露硬膜囊，用Allen打击法造成C6,7段脊髓挫伤，致伤力为350 g/cm。对照组仅咬除上述椎板。所有动物均行右股动、静脉插管。输液使血压维持在13 kPa以上。
(二)给药方式：SCI+PAF及其SCI+ACSF组于受伤前2 min在枕大池蛛网膜下腔向C6，7 相应部位插入1根PE10导管，分别经导管缓慢注入PAF 40 nmol/L(Sigma公司)，溶于ACSF 15 μL,SCI+ACSF组注射等量的ACSF(含131.8 mmol/L NaCl,24.6 mmol/L NaHCO3,2 mmol/L CaCl2, 3 mmol/L KCl, 0.65 mmol/L MgCl2, 6.7 mmol/L 尿素， 3.7 mmol/L glucose; pH 7.1，渗透压为302 nmol/L);SCI+BN52021组于受伤后2 h向右股静脉注射BN52021 10 mg/kg。
(三)PAF含量测定：每组各取6只动物，伤后或术后6 h迅速切取C6,7段脊髓组织，称重后立即放入冷终止反应液(氯仿∶甲醇∶冰醋酸1∶2∶0.04 mL)3 mL中，采用改良的Bligh-Dyer方法和薄层分析分离技术［2］提取PAF。采用PAF定量生物分析技术［3］计算出样品中PAF含量。
(四)颈髓细胞线粒体提取方法：按改良的Koide法［4］，各组于术后或伤后相应时间切取C6，7颈髓组织，称重后迅速放入冷缓冲A液中(含0.32 mol/L蔗糖、10 mmol/L EGTA\, 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4),1 000 g离心10 min，取上清液17 000×g离心20 min，沉淀置于缓冲液B中(含0.32 mol/L 蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4)，在7.5%、12% Ficoll组成的不连续密度梯度上，以68 000×g离心1 h，其沉淀物即为线粒体，置于缓冲B液中低温保存待测。
(五)线粒体ATP酶活性测定：按Faden法［5］测定Na＋-K+-ATP酶活性，反应液成分(mmol/L):NaCl 68,KCl 28,MgCl2 4.5， ATP 30，L-组氨酸69，EGTA18，Tris-HCl 50,pH7.4，有或无oubain条件下释放磷之差值即为该酶之活性。根据改良的Chan法［6］测定Ca2++Mg2+-ATP酶活性，反应液成分(mmol/L):MgCl2 4.5，NaCl 68,KCl 28, Tris-HCl 50, pH 7.4, L-组氨酸69，ATP30，ouabain 1.0，有或无CaCl2 2.0。测定方法同上。在有或无CaCl2条件下释放磷之差值即为该酶活性。ATP酶单位表示：mol Pi/mg pro.h-1。
(六)线粒体呼吸功能测定：用测氧仪连接台式自动平衡记录仪和恒温水，通过氧电极在30℃测定密闭连接搅拌的反应体系中的线粒体耗氧量，并根据线粒体耗氧量(nmo1上一页 [1] [2] [3] 下一页
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