|
绿色荧光蛋白在大鼠骨骼肌中的表达 |
| |
eclean试剂盒纯化，回收DNA片段。
3.大鼠骨骼肌细胞的原代培养
取新生SD大鼠的四肢肌肉，剪碎，用0.16%胰酶和0.08%胶原酶消化，经Percoll密度梯度离心后铺盘培养，基质为Matrigel，培养液为DMEM/F12加10%胎牛血清。
4.脂质体Lipofectin介导的转染实验
按照Gibco公司的试剂盒及其说明书进行。
5.观察方法
共聚焦显微镜(Mendian Instrument Inc产品)激光光源，选用蓝色光(400nm)为激发光，滤光片条件与异硫氰酸胍(FITC)相同，该仪器由中医研究院针灸所提供。
结果和讨论
大鼠骨骼肌在原代培养过程中再现分化的全过程，呈现以下3个时相的变化，经Percoll分离纯化的骨骼肌干细胞(卫星细胞)在接种3d内为梭形的单个核的成肌细胞；4～5d内融合为管状多核的肌管细胞；5～7d形成多核的可收缩的终末型骨骼肌细胞(图1)。
突变型GFP (pGFP65T)DNA在脂质体(lipofectin)介导下，转染48h后用共聚焦显微镜观察GFP在骨骼肌细胞中的表达，镜下可见绿色荧光分布在骨骼肌细胞的胞浆内，约20%～30%的细胞出现。胞浆内荧光强度不同，可分为＋、++、+++、++++4个等级。强阳性一般出现在多核的骨骼肌细胞中，这与其时相变化相一致(图2～4)。
本研究结果表明，突变型绿色荧光蛋白基因(GFP65T)可在原代培养的大鼠骨骼肌细胞中表达，这与Rizzuto等［2，3］的结果相似。我们还观察到GFP在终末分化的骨骼肌细胞中表达水平高于成肌细胞和肌管细胞，这一现象可能与培养过程中骨骼肌分化过程相关，即随着培养时间的推进，表达GFP的细胞会自发融合而导致荧光的增强。至于外源基因尤其是以质粒DNA形式构建成功的重组体，为何更易在骨骼肌中表达尚待探讨。近年人们试图对GFP色基的结构进行改造，通过点突变使之发射更强的荧光［4］。“人化”改造［5］——用人tRNA编码的密码子取代水母来源的序列，构成pGren Lantern质粒，使GFP应用日趋扩大，它不但可在体外表达，而且还在体内表达。
图1 5～7d肌管细胞融合成大的肌纤维并具有收缩功能 ×250
Fig.1 After 5-7days, the myotube fused into large myotube that can contract.×250
图2 绿色荧光在肌管细胞的胞浆中表达(++)
Fig.2 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(++).
图3 绿色荧光在肌管细胞的胞浆中表达(+++)
Fig.3 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(+++).
图4 绿色荧光在肌管细胞的胞浆中表达(++++)
Fig.4 GFP expressed in the cytoplasm of the myotube cells(++++).
作者单位：田竟生 赵春礼 郑少鹏 商永磊 潘海燕 首都医科大学北京神经科学研究所，北京 100054
参考文献
［1］Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 1994, 263(5148):802
［2］Rizzuto R, Brini M, Pizzo P, et al. Chimeric Green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol, 1995, 5(6):635
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 不同功能状态精子表面复型的透射电镜观察
下一个医学论文： 咖啡酸 阿魏酸和CA
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文