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绿色荧光蛋白在大鼠骨骼肌中的表达 |
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田竟生 赵春礼 郑少鹏 商永磊 潘海燕
【摘要】 目的 研究绿色荧光蛋白(GFP)在哺乳动物细胞中的表达。 方法 制备了含绿色荧光蛋白基因的重组DNA，经脂质体(lipofectin)法转染培养的大鼠骨骼肌细胞，用共聚焦显微镜观察GFP的表达。 结果 大约20%～30%的骨骼肌细胞呈现不同强度的绿色荧光。 结论 GFP是研究活细胞生命现象的一种新途径。
【关键词】 绿色荧光蛋白 骨骼肌细胞 大鼠
GFP EXPRESSION IN MUSCLE CELLS OF RATS
Tian Jingsheng, Zhao Chunli, Zheng Shaopeng, Shang Yonglei,Pan Haiyan
(Beijing Institute for Neurosciences, Capital University of Medical Sciences, Beijing)
【Abstract】 Objective The expression of green fluorescent protein(GFP) in mammalian cells was studied. Methods The recombinant DNA containing GFP gene was prepared and transfected into the rat muscle cells in culture using lipofectin method. The expression product of GFP gene was observed by confocal microscope. Results About 20%－30% of living muscle cells expresses the product and appears different density of green fluorescent under confocal microscope. Conclusion GFP can be used as a new approach for studies of life sciences.
【Key words】 GFP; Muscle cell; Rat
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是从发光水母(Aeguorea Vietoria)分离出来的一种荧光蛋白，它在蓝光(主峰400nm，次峰475nm)或紫外光激发的条件下可自发绿色荧光，并由此而得名。GFP由238个氨基酸组成，分子量约为27kD，它所发射的绿色荧光主峰为509nm，肩峰为540nm，该荧光十分稳定，没有漂白现象［1］。GFP色基来自其主要的氨基酸即丝氨酸(serine)－去氢酪氨酸(dehydrotyrosine)－甘氨酸(glycine)在六肽中的环化。对GFP色基改造以加强荧光强度，已成为人们关注的热点。Rizzuto等［2］首先利用DNA重组技术，成功构建了含GFP的重组体，即以巨细胞病毒(CMV)为启动子将GFP cDNA插入真核表达载体Pc DNA－1中，转染HeLa细胞和原代培养的神经细胞等均获成功，其后又将野生型GFP (Wt-GFP)进行改造，将发光色基中的Ser65变成Thr65，形成了突变型GFP (mt-GFP)，即GPFS65T以增强其荧光强度。本研究将此由水母发光蛋白构建的突变型GFPS65T行体外扩增，提取质粒DNA，转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞，用共聚焦显微镜观察GFP在活体骨骼肌中的表达，进而提示GFP是研究活细胞生命现象的一种新途径。
材料和方法
1.材料
质粒pGFP65T由Rizzuto Rosario教授(University of Padova, Italy)惠赠，其内含有GFPS65T基因的cDNA(1.0kb)，克隆于PcDNA-1质粒载体的EcoRI/XhoI酶切位点。Geneclean试剂盒购自Bio101公司，Lipotectin试剂盒购自GIBCO/BRL公司，Matrigel购自Collaborative Biomedical Produce公司，Percoll购自Sigma公司，其他试剂为国产分析纯。SD大鼠由本校实验动物部提供。
2.质粒DNA的制备
GFPS65T转化菌体外扩增，采用常规碱裂解法制备质粒DNA，并经Gen[1] [2] 下一页
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