脆性X智力低下基因FMR1中不稳定DNA序列的研究

    1  材料和方法

    1.1  研究对象及标本  208名人群为本校附属医院门诊自愿受检者，男117名，女91名，年龄24～56岁，平均36.5岁。分别从肘静脉抽取血1～2ml，以草酸钾抗凝，标本按碘化钾法提取DNA。

    1.2  主要试剂  T4多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaza-dGTP等均为NEB公司产品，杂交液、尼龙膜、PCR扩增相关试剂均购自上海生工，探针PE5.1由美国纽约州立发育不全基础研究所Nanbert Zhong博士惠赠。

    1.3  PCR扩增  PCR引物设计参照文献［5］，在FMR1基因内（CGG）n重复区域两侧合成引物。其中上游引物为：5’-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3’，下游引物为：5’-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG -3’。反应体积为20μl，其中包括10×PCR缓冲液，50～100ng模板，每种引物5pmol，200μmol/LdNTP，其中dGTP中75%为7-deaza-dGTP，10%DMSO，1U Taq DNA聚合酶。反应程序为：95℃预变性5min，95℃1min，65℃1min，72℃2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

    1.4  PCR产物的序列胶银染法检测  取10μl PCR产物加入载样缓冲液于6%序列胶电泳。电泳毕经乙酸固定、AgNO3溶液染色及Na2CO3显示后观察结果。

    1.5  Southern印迹杂交  取5μl PCR产物于6%序列胶电泳，常规电转膜，用5′末端标记法以γ-32P-ATP标记探针PE5.1，经预杂交4h，杂交2h，充分洗膜后常规压片，-70℃放射自显影。

    2  结果

    2.1  湖南省人群中FRAXA位点（CGG）n的多态性及分布频率   用PCR方法分析了299条X染色体。经序列胶测定（图2），Southern印迹杂交法验证（图3），表明（CGG）n的拷贝数在20～40之间(见表1)，频率最高的为28（图1）。 

    图1  299条X染色体的(CGG)n多态性分布图

    表1  湖南省人群中299条X染色体的CGG重复数

    2.2  6%序列胶电泳检测PCR产物  见图2。

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