非放射性标记物BrdU研究进展

　　研究非放射性标记物常与放射性标记物相比，以证明特异性，敏感性及其它有关特性，在同一靶细胞比较似乎更具有说服力。然而3H-T d R和BrdU的比标记研究不能在同一时间给药，因两种标记物在同一个细胞增殖周期内竞争胸腺嘧啶激酶。有人认为两种标记先后给药均可，另有主张先标BrdU，理由是3H-TdR放射自显影乳胶用胰酶去除时偶有细胞丢失，致其后BrdU标记信号损失，Lin等强调BrdU标记时间较3H-TdR长约50分钟，如先标记3H-TdR可望BrdU能标记更多早期S期细胞[3]。Thoolen从另外角度观察两种标记染色之间关系，将成年的雄鼠分3组，腹膜下分别注射3H-TdR，BrdU和两中标记物曲小时后取睾丸标记处理，免疫金银法染色，分别计数精原细胞每组平均阳性胞核数量，结果3H-TdR标记为162个，BrdU标记为166个，双标记为146个说明90% BrdU掺入的清原细胞显示3HTd R标记，另有10%胞核仅显示一种标记，无交叉性。3H-TdR的β射线散射范围有限，使放射自显影反应不可能超过远离乳胶1μm以上的胞核，这些胞核或许能被BrdU标记显色，少数细胞仅接受一种标记的确切原因不清楚，也可能与碱基配对所形成的氢键数量有关。此外已证明微波，氯化锂13]、氟尿嘧啶核苷等均有助于BrdU标记。

　　二、检测：

　　BrdU特异掺入S期细胞，通常测定其LI，即S期细胞占细胞周期的百分数，标记阳性为光镜下致密覆盖于胞核上的褐色沉淀物。检测方法用单抗或多抗的免疫化学法，也可用DNA荧光染料染色的细胞化学法。目前常用免疫金银法，因该法不受内源性过氧化酶影响，较免疫酶标法有更好对照背景。不同类型细胞DNA对变性敏感性的差别可能由染色质结构决定，某些类型对变性反应迟钝，使检测不敏感或失败，有人提倡单抗联接BrdU后用FCM检测较免疫组化法更客观省时，且可测出肿瘤倍体[14]。但需注意恶性瘤常伴组织及细胞坏死，BrdU不能掺入死亡细胞，故用FCM分析须除外死亡细胞，否则可被错误当成静止细胞。胰酶和Dnase混合孵育细胞标本有可能克服死亡细胞干扰

　　三、BrdU标记和3H-T d R标记的比较

　　与32P、35S等常用放射性核素相比，3H-TdR释放的β-粒子能量低，散射极少，因此感光乳胶上的成影分辨最高，放射性损伤相对较小，且半衰期较长。3H-TdR标记用放射自显影术和闪烁计数检测，灵敏度高，结果确切。其应用价值已经肯定。因此研究非放射性标记物多以3H-TdR为标准对照。在肿瘤生物学和细胞增殖动力学的研究中，Mayer在试管内分析一组人乳腺癌大样本，比较BrdU和3H-TdR的标记效果，3H-TdR标记234例，平均LI为6.9±0.4%；BrdU标记450例，平均LI6.4±0.3%，两种标记物无显著差异(P＞0.05)。BrdU和3H-TdR标记的肿瘤大小，组织类型，淋巴结转移，胞核大小以及DNA倍体均正相关，充分说明两种标记物之间的密切关系。在同一靶细胞标记也证明90%以上标记3H-TdR阳性细胞也标记有BrdU，反之亦然。

　　四、应用：

　　BrdU标记用于DNA修复、复制、分子杂交的重组DNA技术可替代同位素标记，在分子生物学、遗传学、细胞增殖动力学，肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力等领域有广泛应用价值。Kitazaws等用BrdU标记对白血病细胞HL-60和K562基因表达进行研究，将标记DNA和RNA原位杂交，发现80%用于合成DNA的胸腺嘧啶被BrdU替代[15]。Stevenson等用BrdU单抗和FCM对哺乳动物细胞BALb/C，3T3，Colon26等6种细胞系研究杀瘤性巨噬细胞的细胞毒作用对细胞动力学的影响。受试细胞系接触Mφ之前，先经BrdU脉冲标记，即在适当时间加入B rdU，只作用短时间马上洗去，以保证BrdU掺入DNA的精确时间，结果发现在12小时的细胞培养中，6促细胞系的细胞均可被杀瘤性Mφ阻滞在细胞周期的每一个时相内[16]。

　　近几年来，由于BrdU标记方法敏感、简单和迅速，该技术在肿瘤增殖动力学领域的研究也非常活跃[17-20]。目前BrdU标记不仅用于肿瘤诊断，评估预后，对指导肿瘤治疗已受重视，将活检标本LI作为术后的是否行辅助治疗的依据，

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