右心室肥大时心肌间质胶原改建及其前胶原基因的表达

　　左室心肌间质纤维化已日渐引起人们的重视，心肌间质纤维化是心力衰竭(心衰)进展中的有害因素之一［1］。右室肥大是否和左室肥大一样面临同样的问题? Bishop等［2］对动物右室肥大模型的研究结果表明：早期间质胶原不一定增加，后期则有明显增加，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值亦升高，其原因是由于胶原基因mRNA的水平上调。对于人类，Schwartz等［3］报道婴儿时期法乐四联症的右室胶原面积百分比与正常对照组相差无异，而李新民等［4］观察到法乐四联症患者右室心肌间质有纤维化，但缺乏定量研究。鉴于此，笔者着重研究法乐四联症患者右室肥大时心肌间质纤维化的主要组成部分即胶原的改建和前胶原基因mRNA的表达，为进一步研究心肌间质胶原改建的防治提供依据和新的途径。

　　资料与方法

　　1.病例：术前和术中确诊并行法乐四联症根治术的患者共22例，年龄 1.5～29岁，平均（8.7±6.4）岁；同期非心血管病及胶原系统疾病死亡者为对照组共8例，平均年龄（6.4±5.7）岁，两组间年龄差异无显著性(P＞0.05)。

　　2.胶原分析：法乐四联症组和对照组切取右室流出道心肌组织块，剪去心内膜，预冷 PBS冲洗后液氮速冻，贮存于-70℃。用TRIzol试剂盒一步法提取总蛋白，用改良碱水解法测定羟脯氨酸（标准羟脯氨酸购自中国科学院上海生化所东风生化技术公司），按Lowry法测定总蛋白浓度，然后参照Tanaka和Honda的方法提取胶原，经SDS-PAGE电泳并以对应于标准Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白（Sigma产品）区带的积分值进行胶原Ⅰ/Ⅲ型比值分析。

　　3.探针:(1)含Ⅰ型前胶原α1链cDN A探针［简称 pro α1(Ⅰ)探针］的PUC 18重组质粒由美国康涅狄格大学健康中心儿科的U. Rowe和B.E Kream惠赠，经转化、抽提、酶切、纯化，得到1.3kb pro α1(Ⅰ) 探针；（2）pro α1(Ⅲ)探针为 4.5 kb cDNA(由中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所刘秉慈老师提供)；（3）内对照选用鸡的磷酸-3-甘油醛脱氢酶（GAPDH）探针，片段大小为0.6 kb（由湖南医科大学肿瘤研究所江宁博士提供）。

　　4.心肌组织总RNA的提取和杂交：用TRIzol试剂盒一步法提取心肌组织总的RNA，以放射性同位素32P为标记物，随机引物试剂盒标记探针，各点上样量为20 μg,用斑点杂交法检测 mRNA，将膜上各点pro α1(Ⅰ)、pro α1(Ⅲ)的灰度面积积分除以同一膜上GAPDH的灰度面积积分即为各型mRNA的表达强度。 

　　5.数据计算及统计学分析：实验数据以±s表示，组间比较采用方差分析，t检验和t′检验， 法乐四联症组胶原含量与前胶原基因表达的关系采用直线相关分析。

　　结果

　　1.法乐四联症组心肌间质胶原含量（以羟脯氨酸含量代表）平均（14.85±2.48） μg/mg总蛋白，较对照组平均(7.55±1.89) μg/mg总蛋白明显增多，P＜0.05； 法乐四联症Ⅰ/Ⅲ型胶原比值5.10±1.84，较对照组2.27±0.58显著增高，P＜0.05。

　　2.法乐四联症组右室心肌间质胶原含量与Ⅰ型胶原基因表达强度相关性分析显示，两者呈正相关， r=0.80，P＜0.001；与Ⅲ型胶原基因表达强度的相关分析显示，其相关系数为-0.277， P＞0.10，差异无显著性。右室心肌间质胶原Ⅰ/Ⅲ型比值与Ⅰ/ Ⅲ型胶原基因表达强度比值的相关分析显示，两者呈正相关(r=0.47，P＜0.05)。

　　讨论

　　心肌组织包括心肌细胞和间质，间质约占心肌组织体积的25%，由细胞和基质组成，其中含有内皮细胞、血管平滑肌细胞及成纤维细胞等［5］。胶原为间质基质的主要成分，由Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成，其中80%以上为Ⅰ型，Ⅲ型仅占11%左右，此外还有少量Ⅳ型及Ⅴ型胶原等［6］。 Eghbail 等［7］用原位杂交法在离体心脏细胞上检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA，发现只在成纤维细胞上表达，而心肌细胞未见表达。现一般认为，心成纤维细胞合成分泌心肌间质胶原，一些文献报道在动物的右室肥大模型中观察到右室肥大时其心肌间质胶原有一动态改建过程：早期间质胶原不一定增加，后期则有明显增加，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值亦升高， 其原因是由于成纤维细胞胶原基因mRNA的水平上调［2］。 Schwartz则在研究主动脉闭锁婴儿（5～8个月）的右室心肌间质胶原

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