免疫

　　3 多分析物免疫-PCR

　　在以上的免疫-PCR实验中，生物素化的DNA通过不同的生物素结合试剂（链亲和素、亲和 素）连接到生物素化的抗体上。这样，DNA标记和抗体就被组装在同一位点上，因此可能产生可变的化学计量。另外它需要额外的步骤加入生物素试剂和连接试剂，并需要众多的洗涤步骤去除过量的试剂和非特异性连接试剂的实验组分，作为一个免疫-PCR实验就相当复杂且需要相当多的操作时间。Hendrickson[12]等人用异双功能化学交联剂预先连接好抗体和ssDNA标记，形成标记DNA-抗体偶联物。特别是，他将不同的抗体标上特异的DNA序列，形成一种新的、基于双抗夹心免疫模式的免疫-PCR，并可同时检测多种抗原，避免了免疫实验敏感性的限制和在一个实验中检测抗原的种类。而且，免疫-PCR夹心模式可以用常规的免疫实验完成。这样就大大降低了原先免疫-PCR实验的复杂性，并减少了大量的操作时间。这种免疫-PCR系统的关键改进就是用异双功能化学关联剂制备标记DNA-抗体偶联物。制备过程如下。（1）氨基修饰寡核苷酸与SATA反应，形成乙酰硫代乙酰修饰DNA。（2）Sulfo-SMCC与抗体反应，形成马来酰亚胺修饰抗体。（3）混合马来酰亚胺修饰抗体和乙酰硫代乙酰修饰DNA，并加入羟胺盐酸，在黑暗条件下反应，使抗体和标记DNA偶联。（4）反应混合物用HPLC凝胶过滤纯化偶联物，收集的偶联物在4℃下保存。

　　在这偶联物中，ssDNA是连在抗体的Fc段上，因此并不影响抗体的活性。Hendrickson用此方法把设计独特的三种寡核苷酸（分别为55、85、95个碱基）分别共价连接到三种分析物hTSH、hCG、β-Gal的特异性抗体上，每一个寡核苷酸标记物含有相同的引物序列。这样，一对引物就可以促成三种DNA的共同扩增，Hendrickson用预先制备好的三种抗体-RNA偶联物同时检测hTSH、hCG、β-Gal实验使用双抗夹心模式。实验结果表明，分析物检测的敏感度超过普通ELISA约三个数量级。

　　由于化学合成寡核苷酸标记物序列长度不能超过100个碱基。因此，在多分析物免疫-PCR实验中，ssDNA标记物和引物的设计就受到了限制。Joerger[13]等人用dsDNA作为标记物与抗体偶联。几千个bp的dsDNA可以通过生物学和生物化学方法制备。Joerger通过PCR和单向缺失在以Puc18为基础的重组质粒上制备了各种长度、具有相同引物序列的的dsDNA，选择适合长度的dsDNA作为特异性抗体的标记物。另外，在免疫-PCR实验中，dsDNA比ssDNA具有更多的优越性。DsDNA中的一条链跟抗体的Fc段连接，另一条链在PCR第一步变性步骤中就释放到溶液中，使链复制没有空间位阻。而且dsDNA比ssDNA具有更高的稳定性。此外，长链DNA分子更容易用荧光标记和光吸收检测，并且可以引入更多的非同位素标记，序列长度的提高可以促进杂合检测。

　　4 免疫-PCR扩增产物的ELISA检测

　　pCR扩增产物一般是通过凝胶电泳、EB染色来检测并定量的。也有的是在凝胶电泳后用Southern杂交来检测PCR产物[8,9,14]。1997年，Niemeyer[15]提出所谓的免疫-PCR和PCR-ELISA检测，即用ELISA方法来检测并定量P

　　cR产物。它主要是用一对分别标记了生物素和捕获抗体固定扩增产物，用标记上碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行双抗夹心ELISA。Niemeyer分别检测了鼠IgG、兔IgG和重组HbsAg，证实与凝胶电泳、E B显色相比，ELISA方法检测定量PCR扩增产物结果具有更高的稳定性和可重复性。凝胶电泳、EB显色的变异系数（CV）达到38％，而ELISA的变异系数只有10％。而且，以荧光染料AttoPhos作为显色底物的ELISA检测灵敏度比凝胶电泳、EB显色高10倍。另外，荧光强度和抗原检测量的相关系数也高达99％。这种PCR-ELI

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