孕妇外周血胎儿细胞的富集技术及其在产前诊断中的应用

　　2.4　磁性激活细胞分类法

　　利用磁珠吸附胎儿NRBC，在磁场作用下将胎儿NRBC从孕妇血液中分离出来，包括以下两种方法。

　　2.4.1　磁场正相富集　又称磁场阳性富集。孕妇血液经密度梯度离心制备单细胞悬液，加入磁珠标记的单克隆抗体与胎儿NRBC结合，在磁场作用下阳性吸附NRBC，洗涤并振荡后获取胎儿NRBC。该法简便易行，但富集胎儿NRBC的含量和纯度不高。

　　2.4.2　磁场双相富集　孕妇血单细胞悬液中加入CD14和CD45单克隆抗体，使之与淋巴细胞和非红细胞单核细胞结合，再加入磁珠标记的羊抗鼠IgG，在磁场作用下吸附并去除淋巴细胞和非红细胞单核细胞(反相富集或阴性选择)；剩余物中加入CD71单克隆抗体，使之与胎儿NRBC反应，再次加入磁珠标记的羊抗鼠IgG，在磁场作用下吸附胎儿NRBC(正相富集或阳性选择)，洗涤振荡，获取胎儿NRBC。该法虽操作复杂，但获取的胎儿NRBC产量和纯度很高。Steel等［8］运用该技术可从18ml孕妇血液中获取3×104个胎儿NRBC，胎母细胞比在1∶3000～4∶3000之间。

　　3　临床应用

　　现已从基因和染色体水平对孕妇外周血胎儿细胞作产前诊断。在基因水平主要是用PCR鉴别胎儿性别、研究胎儿β-地中海贫血、Rh血型和HLA多态性。在染色体水平主要是用荧光原位杂交(FISH)诊断21三体、18三体、Klinefelter综合征和47，XXY等染色体病。

　　3.1　预测胎儿性别

　　用孕妇外周血胎儿细胞Y染色体PCR分析预测胎儿性别始于1989年［16］。4年后，Lo等［17］又报道了用妊娠早、中期原血作Y染色体序列分析的结果，发现7例男胎有6例预测正确，6例女胎有5例预测正确，只要300 000个母体细胞中含有1个胎儿细胞，就能成功地预测胎儿性别。现已证实，胎儿NRBC经GPA抗体吸附磁场分离后，PCR预测胎儿性别的准确度和特异度可达100%［5］。目前国内的研究和应用也日趋成熟，已有许多成功的先例［12，18］，接近国际先进水平。

　　3.2　预测Rh血型

　　多数情况下，Rh(D)阴性源于1号染色体Rh(D)基因缺失，若从Rh阴性血液中检出Rh(D)基因，则提示胎儿Rh血型阳性。Lo等［19］用妊娠晚期母体原血预测胎儿Rh血型取得成功。最近Geifman-Holtzman等［20］发现，妊娠早期母体血液富集胎儿NRBC后，用PCR预测Rh血型的特异度和敏感度分别为100%和84%，运用该法判断Rh(D)血型时常会出现血清学与PCR结果不符的问题。一方面，无Rh(D)抗原表达的人仍可能持部分Rh(D)基因片段，若扩增选在该区域内，会出现假阳性结果；另一方面，有人虽能表达Rh(D)抗原，但当扩增区域位于缺少的外显子内或样品不含胎儿细胞时，则出现假阴性结果。

　　3.3　诊断单基因遗传病

　　1990年Camaschells等［21］最早用孕妇外周血诊断胎儿β-地中海贫血/Hb Lepor病获得成功。他们对3例高危孕妇在妊娠8～10周的血液进行11号染色体Lepore突变基因PCR分析，发现2例预测正确，第3例孕妇血液Lepore基因阴性，其丈夫携带正常的Hb基因。从理论上讲，只要能够建立有效的胎儿细胞富集技术和PCR检测手段，许多单基因病的非创伤性产前诊断都能迎刃而解。

　　3.4　诊断染色体病

< br>　　1991年Price等［22］首次用胎儿细胞诊断出1例18三体妊娠。作者用妊娠10周孕妇血液分离胎儿NRBC，用X、Y和18号染色体专一性探针作FISH，发现胎儿NRBC大部分出现以上3种染色体杂交信号，后经绒毛活检证实诊断正确。作者又用同样的方法诊断出1例21三体妊娠。Elias等［23］用CD71 GPA单克隆抗体磁场富集胎儿NRBC，用X、Y、18和21号染色体专一性探针作FISH，共研究了69名孕妇外周血，8例非整倍体妊娠只有1例未被检出，而且无1例假阳性。有人用同样方法诊断出13三体综合征［8］。

　　从孕妇外周血分离胎儿细胞进行产前诊断已取得了重要进展，但其临床应用中的问题仍

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