mRNA差异显示技术在肿瘤研究中的应用

　　2.差异显示应用PCR技术，起到了放大作用，敏感度高。为了筛选低转录水平的mRNA已进行了许多改良，如Hakvoort等［8］将消减杂交与差异显示结合，先通过杂交使差异片段富集，再进行并列比较，则低转录水平的mRNA得到展示的可能性大大提高。又如Ralph等［9］通过2轮PCR扩增（巢式），第2轮引物较第1轮在3′端多2个碱基，使与之匹配的模板减少，模板间的竞争减少,因此低转录水平的mRNA易于被扩增。

　　3.差异显示在测序胶上同时并列比较2个或多个研究对象，比如转移潜能高、中、低的癌细胞系，使后期在选择差异片段时有所参考。同时回收那些出现或消失的差异条带，则可获得“打开”或“关闭”的基因，比如同时克隆激活的癌基因和失活的抑癌基因。

　　4.差异显示可以在2～3周时间内获得结果。最大程度的排除假阳性依赖于三个层次：第一、不同浓度模板的平行反应，及重复实验用于排除由于模板质量数量而导致的假阳性。第二、严格地对照实验，如用缺省逆转录酶或用RNase降解RNA做为阴性对照来排除DNA污染。第三、差异片段的初筛，如将研究对象RNA逆转录,掺入同位素制成探针，分别与点有所有差异片段的尼龙膜杂交(即反向点杂交)［10］，只有那些“此有彼无”的片段进入下一阶段研究，该法有效的集中了目标，削减了繁重的后续工作。

　　三、差异显示在肿瘤研究中的应用

　　肿瘤发生是多步骤的过程，涉及到原癌基因的激活及抑癌基因的失活而导致的细胞失控性生长。在此综述差异显示在肿瘤研究中最多见的4种模式以备参考，可见巧妙地匹配研究对象使差异显示成为克隆肿瘤相关基因、转移相关基因的有力工具。

　　1.差异显示技术用于对比恶性肿瘤组织及其邻近的正常组织：近年有很多将差异显示技术应用于临床手术标本的报道，对比对象涉及脑肿瘤、甲状腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌组织及与其对应的正常组织，试图克隆与癌发生相关的基因。Meyer-Siegler和Hudson［11］将差异显示用于前列腺癌淋巴结转移灶与正常前列腺组织的对比研究，获得166 bp的cDNA片段在转移灶高表达，与人类巨噬细胞移动抑制因子（MIF）93%同源，并在临床已转移的前列腺癌手术标本中得到证实。高表达的MIF将有可能成为转移性前列腺癌的诊断标志物。对于临床工作者来说，差异显示技术无疑有着标本来源丰富的优势，使临床研究深入到基因水平。但必须意识到慎重选择对比对象的重要性,以确保二者具有高度可比性。如果能找到在临床指标如治疗反应、复发率、转移率、生存率等方面高度可比的模型，则所克隆基因有可能成为新的诊断及预后的分子标志物。

　　2.差异显示用于肿瘤细胞系的研究：肿瘤基础研究中已建立了许多肿瘤细胞系及亚系，具有遗传背景一致、表型差异单纯的优势，是差异显示良好的模型。为了研究肿瘤转移相关基因，Lim等［12］以鼠结肠腺癌细胞系的3个具有不同转移潜能亚系作为差异显示的对象。当接种于裸鼠时，NL4亚系无转移能力，而NL17亚系（i.v.）和NL22亚系(s.c.)在肺部形成巨大转移灶。各细胞系转移表型的差异反映了其基因水平的差异。差异显示获得新基因HMC在高转移亚系NL17及NL22中高表达，在低转移亚系NL4中极低表达。Northern杂交证明在13例结肠癌病人中7例的原发癌灶及转移灶HMC表达较正常粘膜高，最高可达38倍。HMC与有丝分裂调控蛋白家族有部分同源性，为其功能研究提供了线索。为了探讨乳腺癌演进过程中表达基因的变化，研究者以乳腺癌细胞系MCF-7及MCF-7ADR作为研究对象［13］。这两个细胞系是乳腺癌演进的模型：MCF-7代表乳腺癌早期，雌激素依赖，雌激素受体阳性，三苯氧胺治疗有效，波形蛋白阴性，对阿霉素敏感，体外matrigel侵袭试验及裸鼠体内试验均不侵袭转移；相反MCF-7ADR代表进展期乳腺癌，不依赖雌激素，雌激素受体阴性，三苯氧胺治疗无效，波形蛋白阳性，对阿霉素不敏感，表现出体内外侵袭转移能力。差异显示获得了一个新基因PAP在MCF-7ADR中高表达，其在进展期乳腺癌细胞系MCF-7ADR中的作用尚待研究。

　　3.差异显示用于转染细胞的研究：细胞转染技术在肿瘤研究中正被广泛应用，差异显示对比转染前后,可用来研究所转染基因的下游基因及作用途径。将最早被克隆的癌基因ras及突变率最高的抑癌基因p53（温度敏感型）共转染鼠胚胎纤维母细胞(REF)得到亚系A1-5,在非许可温度培养时p53为突变型，在许可温度培养时p53为野生型［14］。提取各细胞系mRNA并列比较，获得新基因

上一页  [1] [2] [3] 下一页