aaat-3′。TTV DNA提取采用SDS-蛋白酶K裂解法。第一轮和第二轮的PCR循环参数为94℃,30秒;55℃,30秒;72℃,50秒,终末延伸5分钟,两轮均为30个循环。扩增产物经溴化乙锭染色,2%琼脂糖凝胶电泳,然后在紫外灯下观察鉴定。每次PCR均设阴性、阳性和空白对照。
三、PCR产物序列测定:扩增产物经0.7%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离,切下目的DNA条带,用原平公司纯化试剂盒进行回收纯化,采用双脱氧链末端终止法直接测序,测序试剂盒购自Promega公司,测序仪为Bio-Rad公司产品。
结 果
一、不同人群TTV DNA的检出情况:由表1可见,TTV DNA阳性率以妓女最高,以下依次为血液透析病人、献血员、慢性丙型肝炎病人、静脉吸毒者和常规体检人群,11名非甲~庚型肝炎病人中未检出TTV DNA。
TTV与乙型(HBV)、丙型(HCV)、戊型(HEV)和庚型肝炎病毒(HGV)合并感染情况见表2。TTV与HCV合并感染最为常见,其次是与HBV,与HEV和HGV合并感染较为少见。此外,还可见与HBV和HCV、与HCV和HGV,以及与HCV、HEV和HGV重叠感染者。单独TTV DNA感染仅占37.8%。
表1 不同人群TTV DNA检出情况
检测人群 检测人数 TTV DNA阳性例数(%)
常规体检人群 301 31(10.3)
献血员 32 14(43.8)
静脉吸毒者 32 5(15.6)
血液透析病人 11 6(54.5)
妓 女 20 13(65.0)
慢性丙型肝炎病人 16 4(25.0)
非甲~庚型肝炎病人 11 0(0.0)
表2 TTV与HBV、HCV、HEV和HGV合并感染情况
合并感染组别 例数 构成比(%)
TTV+HBV+ 5 11.1
TTV+HCV+ 15 33.3
TTV+HEV+ 1 2.2
TTV+HGV+ 1 2.2
TTV+HBV+HCV+ 3 6.7
TTV+HCV+HGV+ 1 2.2
TTV+HCV+HEV+HGV+ 2 4.5
单独TTV+ 17 37.8
合 计 45 100.0
二、1株TTV部分基因序列测定:为确定nPCR检测TTV DNA结果的可靠性,我们对1株TTV DNA阳性的nPCR产物直接进行了序列测定,并与日本报道的TTV DNA序列(AB008394)进行了比较(图1),其同源性为98.7%。
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