免疫细胞分泌研究进展

　　2.2 免疫细胞分泌抗体或细胞因子的研究

　　经过适当处理, 免疫细胞可应用膜片钳测量细胞膜电容。膜电容正比于细胞膜表面积。当分泌小泡与细胞膜溶合并胞吐时, 便伴有膜电容的增加。人的中性粒白细胞是成功应用whole-cell和on-cell膜片钳法进行研究的少数免疫细胞之一［10］。通过膜片钳电极向细胞内导入GTPγS,可引起膜电容从静息时的3 pF增加到8～9 pF。有趣的是虽然GTPγS导入可引起暂时的Ca2+浓度升高和膜电容的增加,但当加入高浓度的Ca2+缓冲物质将钙升高阻断后, 膜电容的升高依然存在而不受Ca2+离子的影响, 表明GTPγS引起的分泌不需要Ca2+离子的参与,属于Ca2+非依赖性分泌, 这与经典的Ca2+依赖性分泌明显不同。进一步研究Ca2+和GTPγS的促分泌效率的差别和他们分别在什么情况下起作用将是一个重要课题。当向细胞导入高浓度Ca2+时,分泌过程呈现2种不同的动力学成分, 第一相只需要1～10 μmol/L的Ca2+, 而第二相则需要100～300 μmol/L的Ca2+浓度,他们分别对应免疫细胞内不同性质的囊泡, 即不同的Ca2+浓度控制不同的囊泡分泌, 以适应不同的细胞功能。

　　lollike等［2］应用细胞贴附式膜片钳技术在中性粒白细胞研究了免疫细胞脱颗粒的动力学, 包括单个囊泡融合的动力学特性, 用这种方法, 他们可以分辨出1 fF的阶梯状电容变化(对应单个囊泡分泌事件)。在形成封接后,他观察到一种自发的阶梯状膜电容降低, 代表直径60～165 nm的囊泡小泡的内吞。 当用Ionomycin刺激后, 可观察到0.1~5 fF大小不等的阶梯状电容升高,代表了白细胞不同类型囊泡的分泌(图2)。对于直径＞180 nm的囊泡可以直接观察到单个融合孔活动, 融合孔起始平均电导为150 pS, 最小的仅有35 pS,随后融合孔逐渐扩大, 扩展速度有快有慢, 与报道的巨大的囊泡融合孔特性类似。这是首次直接观察到直径＜500 nm的小囊泡的融合孔, 根据其起始电导小的特征,可以推测融合孔的形成必须有蛋白质参与。免疫细胞融合孔也存在闪烁开闭(flicker)的现象［11,12］, 这表明小囊泡的胞吐是可逆的。在融合孔闪烁过程中,其电导通常＜1 ns, 并且在开和关两种状态的大小是一致的, 这表明中性粒细胞的融合孔在低电导时不存在细胞膜脂质的流动; 这与肥大细胞上的研究结果不同,后者闪烁更快［13 ］, 融合孔打开值较关闭时的值小, 存在细胞膜脂质不断转移到囊泡的现象［14］。Lollike还发现一种假闪烁(pseudoflikers)现象:单个囊泡融合后会观察到一种渐进性的膜电容下降, 其原因尚不清楚, 可能是几个直径＜60 nm的小囊泡的快速融合的结果,也可能是电极内的小部分膜片逐渐贴到电极壁上所致。关于膜融合孔调控的分子机制研究还刚刚起步。马的嗜酸性白细胞含有巨大囊泡, 它的融合孔的扩大可由Ca2+和PKC通过不同的机制进行调节［15］;粒细胞的融合孔似乎在开放状态下也受到蛋白质的调控, 而中性粒细胞的融合孔的调控机制尚是空白。与融合孔的研究相比, 对膜分裂孔(fission pore)的研究非常有限, 因为胞饮囊泡通常非常小, 不能被全细胞膜电容记录所分辨, 而细胞贴附式膜电容记录可分辨出单个囊泡的胞饮, Lollike已经分辨出直径300～700 nm的小囊泡分裂孔［2］。该研究的进一步深入, 有望揭开囊泡融合晚期分子活动的神秘面纱, 这不但对细胞免疫学而且对神经科学和内分泌学都意义深远。

　　受whole-cell技术约束, 许多免疫细胞还不易用膜电容记录。但较新的微碳纤电极(CFE)技术可能弥补此缺。这种电化学方法灵敏度极高,可检测到单个小泡分泌［16］。

　　2.3 免疫细胞分泌功能的调控

　　免疫系统是生物体的防御系统, 免疫细胞抗体和细胞因子的分泌受到细胞内信号分子和细胞周围微环境的精确调控。 对肥大细胞的研究表明, PKC活性是调控肥大细胞脱颗粒的重要因素［17］。肥大细胞激活后,细胞内多个信号转导通路被激活, 导致炎症前细胞因子立即释放和其他细胞因子的延迟性释放。 这一过程除需要激活酪氨酸激酶(tyrosine kinase)外,还需要PKC的激活来使丝氨酸和苏氨酸磷酸化。对于PKCβ缺陷的小鼠, IL-6的分泌反应消失或减弱,而IL-3引发的肥大细胞增值反应和凋

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